Re: [求救] Recombinant protein in insoluble form
※ 引述《egoweaver (Hiko)》之銘言：
: 小弟最近在做protein expression的實驗，用的vector是pET30a和pGEX4T-1
: 第一次養的時候因為在養1ml的時候太早養，怕它長過頭所以流程變成：
: 1.pick 1 colony(pET/pGEX in BL21) in selective LB, incubate at 37℃(4hr)
: 2.In 4℃ refrigerator for ~2hr
: 3.dilute 100ul in 100ml of selective LB, incubate at 37℃ (~2hr)
: ↑不知道為什麼長很慢
: 所以養比較久。
: 4.Induction(1M IPTG 100ul)
: 5.Incubate at 37℃ (13hr)
: 結果最後induction和no-induction跑SDS-Page的結果看不出來有什麼不同，感覺沒有成功
: induction，學長建議我改25℃其他condition不變再養一次試試看。
: 第二次的流程和第一次一樣，除了1ml的菌液沒有進冰箱，然後induction後改成25℃養，
: 這次induction就有起來(雖然我覺得我太晚induction了，覺得時機很不好拿捏……)，不
: 過做出來的protein都是insoluble form。
: 我應該要怎麼改下次養的condition比較有機會做出soluble form的protein呢？
: ．在板上看到有人把溫度降到18℃在養，這樣子是要養比較久是嗎？
: ．學長建議我把養的時間縮短看看會不會不是全部的protein都進inclusion body。
: ．老師覺得把Medium換成M9有機會做出soluble form，但是老師說他覺得我不管怎麼試機
: 會都不大Orz
首先, 你induction的時機,菌液必須要達到 OD600 0.6~0.8.
以你敍述的培養條件, 我看你的菌液不可能達到那個吸光值.
其次, 你說的降低培養溫度當然也是一個做法, 但降低 IPTG induction 濃度更重要.
由你用的 1 M 降低至 0.1 mM ~ 1 mM.
此外，還可以改善的方法是, 在lysis buffer中加些component.
最直接的方法是用 denature 方式把inclusion body中的protein 溶解出來,
再將buffer 置換, 讓protein refolding回去.
這個方法的好處是可以得到大量的蛋白, 缺點是, 可能會造成protein misfolding
而可能造成你的蛋白失去活性.
另外, 就是在Lysis Buffer 中, 增加下列配方.
1. 200 mM ~ 300 mM NaCl
2. 5~15% glycerol
3. 1~5 mM DTT / beta-mercaptoethanol
4. 0.1 ~ 0.2 % Triton X-100
的確可以增加 inclusion body 中蛋白的溶出率.
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