Re: [討論] 關於ligation問題?
※ 引述《conie0831 (cc)》之銘言：
: 在做ligation時,insert至少要多少總量,才比較容易成功(都依照insert:vector=3:1).
: 因為我的insert濃度很低,約5ng/ul,我不知道我的insert濃度是否會太低?
: 另外insert經過限制?切割後,一般會在進行膠體純化,像我的insert濃度這麼低,如果經過
: 這個步驟,insert一定又會損失(怕insert全部回收不回來),所以這個步驟是否可省略,
: 直接將restriction enzyme solution進行ligation,是否可行?
你的Insert 是cDNA, 至少需經過PCR amplify 才能進行後續的處理.
所以你說的濃度太低是指 PCR 後的量很少嗎？
有人建議你PCR 後接到T-vector,這也是不錯的建議.
可以避掉量太少及PCR mutation的問題.
如果是PCR的產量太少, 那你就重新設計primer, 或改PCR的條件, 以增加PCR產量.
這是關鍵步驟, 要能克服才能做後面的事.
一般我的做法是將RE site的序列加在primer序列中, PCR之後過PCR clean,
就進行enzyme digestion.之後再過一次PCR clean, 就可以進行ligation.
: 直接將restriction enzyme solution進行ligation,是否可行?
至少要經過PCR clean column, 去掉buffer的salt.
如果只是切掉一部份的殘基, 那些殘基在經過desalt的步驟就可除去.
因為PCR clean column 只能抓大於100 bp的DNA 片段.
因此, 如果你切的是小片斷, 是可以不用gel elute的.
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