[討論] 關於ligation問題?

看板Biotech作者 (cc)時間17年前 (2009/03/03 22:05), 編輯推噓7(7推 0噓 15→)
留言22則, 5人參與, 7年前最新討論串1/3 (看更多)
在做ligation時,insert至少要多少總量,才比較容易成功(都依照insert:vector=3:1). 因為我的insert濃度很低,約5ng/ul,我不知道我的insert濃度是否會太低? 另外insert經過限制?切割後,一般會在進行膠體純化,像我的insert濃度這麼低,如果經過 這個步驟,insert一定又會損失(怕insert全部回收不回來),所以這個步驟是否可省略, 直接將restriction enzyme solution進行ligation,是否可行? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 220.135.98.104
推
03/03 22:06, , 1F
Insert切多一點不就好了Orz
03/03 22:06, 1F
推
03/03 22:11, , 2F
你enzyme digestion的buffer system不適用於T4 ligase吧
03/03 22:11, 2F
推
03/03 22:12, , 3F
拿RE完的直接ligation..那你原insert的vector不就再
03/03 22:12, 3F
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03/03 22:12, , 4F
黏回去...
03/03 22:12, 4F
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03/03 22:12, , 5F
這樣整個ligation環境不都一些亂入的buffer...
03/03 22:12, 5F
推
03/03 22:40, , 6F
如果切位可以接的上去的話就可以,多挑一些一定挑得出來
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03/03 22:42, , 7F
buffer跟原先vector的干擾都不會有問題,挑對大小的plasmid
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03/03 22:42, , 8F
就OK...
03/03 22:42, 8F
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03/03 22:44, , 9F
另外insert濃度太低,以commercial vector養菌放大再剪切回收
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03/03 22:45, , 10F
就可以放大濃度...
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03/03 23:04, , 11F
我的insert是一段cDNA,尚未接入cloning vector中
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03/03 23:06, , 12F
所以無法利用養菌放大方式來放大濃度
03/03 23:06, 12F
推
03/03 23:13, , 13F
PCR呢? 多P幾管再一起clean up或酒精沉澱
03/03 23:13, 13F
推
03/04 00:26, , 14F
cDNA若不是單股,一定可以T/A cloning,即使是RACE或是RT出來
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03/04 00:27, , 15F
的經過養菌放大的質量都比P多管PCR產物回收來的好
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03/04 00:28, , 16F
與其一開始搞個難題去衍生後續實驗的麻煩,不妨考慮一下
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03/04 00:31, , 17F
一開始在前期得到大量精確的DNA順順的作下去,參考一下^^
03/04 00:31, 17F
推
03/04 00:50, , 18F
當然如果PCR就可以得到大量產物的話PCR就好,原po的問題
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03/04 00:51, , 19F
若是PCR出來的band或是經由非PCR方式得到cDNA的話,建議養菌
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03/04 00:52, , 20F
^band很少^
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11/11 01:19, , 21F
11/11 01:19, 21F
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01/03 16:52, 7年前 , 22F
一開始在前期得到大量精 https://noxiv.com
01/03 16:52, 22F
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