[求救] 關於protein purification

看板Biotech作者theessential (...)時間17年前 (2009/01/12 01:27)推噓4(4推 0噓 11→)

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先謝謝大家進來看我的問題~^^" 我想要純化出來的protein大小約52kD induction後也跑過PAGE確認想要的protein有被induced出來並且在對的位置是以French Press破菌這個protein學姊之前有純化過差別便在於後來後來在C端接了個tag 由於之前學姐所用的是denature的condition 所以我所使用要通column的buffer全部都含6M Urea 可是我在純化時卻沒有辦法elute到足量的protein 收集了破菌後的supernatant與通過column後相比較發現protein幾乎沒有binding上去 SDS-PAGE上 elution的部份根本看不見...@@" 後來做了Western 發現elution部分有protein 但是和column流出的相較真的是很少很少這是我使用的binding buffer配方: 5mM Imidazole 0.5M NaCl 20mM Tris-HCl 6M Urea 調整pH至7.9 (按Novagen His-Bind Resin column protocol指示) 所使用的所有buffer都確定過pH值無誤也曾純化過在同一個plasmid上一定會被E.coli(BL21 DE3)表現的蛋白可以成功的純化出來也有將plasmid送去sequence 也確定His tag及所要的protein存在現在找不出來protein為何會無法binding到column上總覺得5mM Imidazole已經很低了還是說應該試一試不含imidazole的binding buffer呢? (但是會怕non-specific binding...) 建議調pH值嗎? 該怎麼調比較恰當呢? 或著有其他的建議? 因為是新手經驗不多拜託大家幫忙了謝謝大家! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.62.101

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