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討論串[求救] 分段cloning
共 6 篇文章
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#6
Re: [求救] 分段cloning
推噓2(2推 0噓 1→)留言3則，0人參與, 最新作者veltine (Time go by~~~)時間17年前 (2008/08/29 02:04), 編輯資訊
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我之前也是要將一段gene clone (636bp)出來. Great！之前提到的方法，居然有人試過…呵呵…太好了…. 謝謝voen大的經驗分享…. 另外想請教兩個問題：. Q1：在ligation中的比例是1:3，大片段是1而小片段是3嗎？. Q2：而你提述的把成功ligation的片段，從ge
#5
Re: [求救] 分段cloning
推噓0(0推 0噓 0→)留言0則，0人參與, 最新作者voen (新的開始~加油吧)時間17年前 (2008/08/29 01:31), 編輯資訊
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我之前也是要將一段gene clone (636bp)出來. 再和一段140bp的promoter 及 310bp的terminator接起來. 那時用的方式是overlap PCR 但最後會有其他雜band. 改變許多方式 但定序後都不是完整的整段序列. 所以最後改為 直接將兩片段ligation
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#4
Re: [求救] 分段cloning
推噓3(3推 0噓 14→)留言17則，0人參與, 7年前最新作者veltine (Time go by~~~)時間17年前 (2008/08/28 19:52), 編輯資訊
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我是用Advantage 2 Polymerase號稱可以PCR出13kb！. 用Pfu P完直接ligation是接不起來的歐.... 因為PCR product沒有多一個A…對了為啥會多一個A啊？. 是的，其它的gene我也是用這種方法接上去的…. 非常的簡單，但是TA vector有點貴…Or
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#3
Re: [求救] 分段cloning
推噓0(0推 0噓 0→)留言0則，0人參與, 最新作者sGoat (無三小羚羊)時間17年前 (2008/08/28 17:17), 編輯資訊
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先無差別clone起來再去做Rapid Screen,挑出你要的3.5K的clone來做.... 請問是用Taq去P還是用Pfu?. 用Pfu P完直接ligation是接不起來的歐.... 1.將你步驟一PCR出來的3.5K片段clone進T-A cloning vector.... 挑出來之後純
(還有110個字)
#2
Re: [求救] 分段cloning
推噓2(2推 0噓 2→)留言4則，0人參與, 最新作者veltine (Time go by~~~)時間17年前 (2008/08/28 16:07), 編輯資訊
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3.5kb說大不大、說小也不小…. 這個gene在我手上就是clone不出來…Orz. 提到primer專一性不夠的原因，我的primer設計出來有33-35mer. (含有酵素切位)，我也blast primer在NCBI上，確時是會有blast. 到genomic DNA，但是我的total R
(還有479個字)
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