Re: [求救] Cloning問題
※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之銘言：
: 最近在clone一些轉錄因子大小約1-3kb左右
: 先簡述一下我如何clone…Orz
: 1.先確定這些基在老鼠身上，何時、何處會表現？
: 2.利用invitrogen Trizol萃取RNA
: 3.利用Bio-Rad iScript-cDNA-Synthesis合成cDNA
: 4.設計primer(長度約30左右，因有加RE site)
: QA：不知道是我設計的primer專一性不夠高或是其它
: 原因，PCR完之後跑膠會有很多band？已試過
: gradient temp，還是有很多band…Orz，所以我
3'以及5'UTR所以長度有很多種
: 直接切下我要的大小片段的gel，之後subclone
: 到Topo vector上，在colony PCR及enzyme digestion
: 中，其片段大小都是正確的…
: QB：我成功ligation幾個gene到vector上，定序之後
: 發現只有primer序列是對的，而中間序列完全是
: 錯的，與老闆討論之後，有可能是genomic DNA
: 污染了？
先看看是不是primer設計不良
: QC：回頭看看合成cDNA用的kit，說明書上寫最佳合成
: 片段約1kb，但是有我clone出正確的gene約1.5kb
: ，是這個原因造成我有些gene，clone出來是錯誤
: 的序列嗎？
1-3K是正常情形,若長度更長要分兩次加RT酵素效益才比較好
protocal上那樣說是因為它預設RT時間為一小時左右
: QD：有人知道reverse transcriptase的合成速率嗎？
你看它建議時間與最佳片段就可大約推算出來
但是一般來說還是不會比Taq快...
: 一般的incubation時間只要一小時左右，這樣要
: clone大片段gene會clone的出來嗎？可以推薦
: clone專用的reverse transcriptase嗎？
其實MMLV RT都大同小異差的是kit裡面附的primer
所以回頭看一下你的primer比較重要
: 以上感謝各位回答…謝謝
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