[求救] Cloning問題
最近在clone一些轉錄因子大小約1-3kb左右
先簡述一下我如何clone…Orz
1.先確定這些基在老鼠身上，何時、何處會表現？
2.利用invitrogen Trizol萃取RNA
3.利用Bio-Rad iScript-cDNA-Synthesis合成cDNA
4.設計primer(長度約30左右，因有加RE site)
QA：不知道是我設計的primer專一性不夠高或是其它
原因，PCR完之後跑膠會有很多band？已試過
gradient temp，還是有很多band…Orz，所以我
直接切下我要的大小片段的gel，之後subclone
到Topo vector上，在colony PCR及enzyme digestion
中，其片段大小都是正確的…
QB：我成功ligation幾個gene到vector上，定序之後
發現只有primer序列是對的，而中間序列完全是
錯的，與老闆討論之後，有可能是genomic DNA
污染了？
QC：回頭看看合成cDNA用的kit，說明書上寫最佳合成
片段約1kb，但是有我clone出正確的gene約1.5kb
，是這個原因造成我有些gene，clone出來是錯誤
的序列嗎？
QD：有人知道reverse transcriptase的合成速率嗎？
一般的incubation時間只要一小時左右，這樣要
clone大片段gene會clone的出來嗎？可以推薦
clone專用的reverse transcriptase嗎？
以上感謝各位回答…謝謝
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