Re: [求救] western blot transfer 效率不好
借用一下這個標題問一下大家...
我是用wet transfer的方式
我們實驗室從以前開始都是定V的...可是看到許多protocol都是定A的
那到底怎樣的方式比較對?? 或者..這兩個方式可以換算嗎??
爬文了..很多人都說是定A比較對...但原因是什麼呢??
protocol-on line 也有很多人寫定V...
一般來講好像都是100V,60min, 也可以是90V,90min...,60V,4hr...??V, O/N
請問這個要怎麼換算??
還是只是憑經驗???
我們實驗室對普通的protein transfer都用100V,60min (用NC paper)
如果是1.5mm厚的話會transfer久一點~75min
但大概150kD大小的protein(看Marker) 會有一些殘留在gel上
(用6% 8% 10% SDS-PAGE都是如此)
所以這時候就要加0.1% SDS囉??
最後一個問題...如果同時要看250kD的還有20kD的protein
是不是很難在同一張membrane上看到??
因為transfer的buffer就要不同了?
要讓分子量大的transfer過去完全 又不讓分子量小的transfer過頭
這時候是要分開transfer嗎??
謝謝大家 ^^
※ 引述《KIKO880 (大姑)》之銘言：
: 現在有找到一些方法
: 1.降低SDS PAGE%
: 不過我現在已經是用10%
: 2.transfer 久一點
: 之前都只有兩小時，今天已經在試O/N
: 3. buffer 加0.1% SDS 以及降低methanol濃度
: 如果膜是PVDF的話，可以不加methanol
: 4. wet 效率比semi-dry好
: 我是本來就用wet的了
: 謝謝各位大大的幫忙
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◆ From: 219.68.81.125
※ 編輯: anitaGo 來自: 219.68.81.125 (08/19 01:21)
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