Re: [求救]有關RT-PCR調勻GAPDH的方法
1. RNA isolation
2. to remove DNA residue
3. 至少200x稀釋定量RNA
取1.2ul RNA / 240ul水,用80ul的cuvette測3次OD,其結果取平均數換算實際濃度
4. Amexxxxx Ready to go RT-PCR 豬豬 超好用,一科科的beads等於廠商幫你
做好酵素的定量避免人為誤差,只需要補水跟等量RNA
所以只要根據在第三步所得知的RNA濃度,取出等量RNA在用水補到大家一樣體積
在加進bead混合均勻
5. 根據說明書,用PCR machine 合成 cDNA pool
6. PCR定量 housekeeping gene"s"
如果上述步驟做得紮實,以我個人的經驗來說,有非常非常多次
甚至只需取等體積的cDNA,就能獲得亮度以及大小一致的產物
P.S. 請load 大well
多測試另一個housekeeping gene
PCR cycles 請控制在 20-22個
7. 微調 PCR 定量
band 粗一點 下次 cDNA 就load 0.9x 體積, band細一點就反之 load 1.x
總之自行找一個當作基準點,或多或少自行判斷
8. 最後根據以上 PCR 目標基因
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