[求救]有關RT-PCR調勻GAPDH的方法

看板Biotech作者 (..............)時間17年前 (2008/06/23 01:11), 編輯推噓4(4推 0噓 11→)
留言15則, 4人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
大家好,最近我開始學習到RT-PCR的這項技術 不過實驗總是卡在一個環節好久一段時間 在RT做完之後轉成的cDNA拿去跑GADPH 雖然在轉RT前已經盡量準確的測量濃度 但跑出的電泳圖還是明亮不一 為了在同濃度的GADPH下去跑其他基因 我不得已跑了一次又一次的重跑PCR 但是PCR時要加多少體積的cDNA實驗室學長的建議 是看圖憑經驗要加多少 請問各位,有比較有技巧的方法,可以不用看圖猜要加多少量的cDNA 才能準確的調勻,或知道加多少cDNA 這裡是我的電泳圖,在跑PCR前我已儘量將濃度調到大約20ng/μl,然後我沒個都加4λ 跑PCR: http://www.wretch.cc/album/show.php?i=applekate&b=13&f=1134192604&p=0 我已經試過用image J看band的亮度做比較,不過似乎也沒有用 請大家幫我解答 謝謝!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 220.141.11.101 ※ 編輯: katty7389 來自: 220.141.11.101 (06/23 01:15)
推
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RNA quality可能要好一點
06/23 03:10, 1F
推
06/23 11:30, , 2F
如果這幾管是分別跑RT的那就沒辦法,因為牽涉到每管效率不同
06/23 11:30, 2F
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06/23 11:30, , 3F
跑膠定量可能已經是最準的辦法了
06/23 11:30, 3F
推
06/24 08:47, , 4F
RT-PCR要定量本來就有點靠運氣~既然有影像分析軟體
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06/24 08:48, , 5F
就把GADPH的強度當分母約分~不同組的表現就可以比較了
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06/24 08:49, , 6F
以你的圖來說 除了最後一個太低 其他組都可以這樣比
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06/24 08:50, , 7F
另外PCR反應有可能會飽和 所以cyle數要多試幾個
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06/24 08:51, , 8F
你的cycles數好像都太高 所以band有點爆掉了
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06/24 08:51, , 9F
試試看少個5~10吧
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06/24 10:47, , 10F
請問PCR反應怎麼看知道他爆掉,是因為BAND看起來很濃嗎?
06/24 10:47, 10F
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06/24 11:20, , 11F
還有,最近跑出的BAND上游又會出現淡淡比較大的BAND
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06/24 11:21, , 12F
請問是condition不OK的關係嗎
06/24 11:21, 12F
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06/24 11:25, , 14F
06/24 11:25, 14F
推
06/25 03:16, , 15F
有雜band就加一下annealing溫度吧
06/25 03:16, 15F
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文章代碼(AID): #18NeVVdG (Biotech)
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