Re: 有關his-tag純化
※ 引述《tzengchichau (無)》之銘言：
: ※ 引述《STEVENUA.bbs@bbs.Life.NCTU.edu.tw (星空下的神話)》之銘言：
: : 想請問一下各位先進
: : 在純化蛋白質中，我要純化his-tag的融合protein，使用的是Ni-NTA來純化，
: : 想請教的部分就是：
: : 1.為什麼buffer的ph值是保持在7.9呢?
: PH值也會影響his_tag PROTEIN binding 但PH值只要7.4_到8都可以啊
: 不一定要在7.9。
: : 2.binging buffer中有的會加入imidazole,這個物質不是只和histidine競爭Ni，為什麼
: : 會用在binding buffer裡呢?(其實也想問一下binding buffer的功能是什麼)
: 低濃度的IMIDizole是用來洗去column非專一性的結合蛋白。
: 也可以再加入高濃度的NACL這樣最後收集的蛋白會比較純
: : 3.elution buffer中有imidazole我能理解，可是washing buffer中為什麼也有呢?
: : 實驗室使用的imidazole濃度分別為：
: : 8X binging buffer：40mM imidazole
我猜你要打的是binding buffer
: : 8X washing buffer：480mM imidazole
: : 4X elute buffer：4M imidazole
: : 求救一下了>"<
binding buffer有imidazole是為了減少非專一性蛋白
washing buffer當然也要用imidazole 理由也一樣 為了增加純度
會跟ni-nta接合只要有imidazole group就能接合...很難避免只能減少
所以很多非你目標的protein也能去搶這些接合位
在wash的時候當然要用一些去把他洗掉..當然同時也會犧牲一些你的目標protein
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上帝曾經說過 :
當一個人打你右臉的時候
你就要用日耳曼背橋摔壞它的左臉
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推
04/30 12:52, , 1F
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