Re: [求救] 2D真難搞
※ 引述《kakaman (日子過的真快阿)》之銘言：
: ※ 引述《kakaman (日子過的真快阿)》之銘言：
: sample的處理是把細胞離下來後
: 用lysis buffer(CHAPS+Urea)+PMSF去破細胞
: 放在冷房摩天輪轉一個小時
: 接著13000rpm 20min
: 吸上清液 定量後上IEF
我來說說我之前碩士做2D sample preparation的過程：
1.400uL蛋白質粗抽液+100uL 50%TCA in Acetone
(由於我的sample是葉片，為了去色素使用Acetone)
2.votex均勻後置於-20度1小時以上
3.4度下12000rpm 離心10 min
4.利用iced Acetone清洗pellet三次
(均需攪散pellet後離心再去除Acetone)
5.以Rehydration buffer回溶(即原po的lysis buffer)
6.利用sonicator在冰上震盪30~60min增加回溶
7.12000rpm 10min 4度C後去除pellet留下上清液以BCA定量
整體來說
做蛋白質實驗時切記冰上處理
以免產生carbamylation
利用沉澱法來去除一些cell中的contaminants
(ex:lipid,DNA/RNA,polysaacharides等)
常用沉澱法有:
1.TCA (Add TCA to extract to final conc.10-20%)
2.Acetone (Add at least 3 vol. of ice-cold acetone into extract)
3.50% TCA in Acetone(將5g TCA溶於10mL Acetone中)
(final TCA conc. is 10%)
希望有幫上一點忙
另外染色法也會影響你觀察2D的結果
常用CBR,silver stain或是Zinc stain
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.228.195.54
討論串 (同標題文章)