[求救] PCR的問題

看板Biotech作者 (owl628)時間16年前 (2008/04/16 00:27), 編輯推噓3(303)
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我的primer每條都是80b.p 只有每條的前面20b.p會去和template(plasmid)annealing 其餘的部分是用來做同源互換的 我用的酵素是pfu 但是我跑膠後怎樣都看不到我要的片段(約1900b.p) template 1 10Xbuffer 2.5 94度 5分 2mMdNTP 2.5 94度 30秒] primer-F 0.5 55度 30秒] 30cycle primer-R 0.5 72度 2分 ] pfu 0.3 72度 7分 d2H2O 17.7 4度 無限 -------------------- 25ul 以上是我的條件,請問有哪邊可以改進的,謝謝^^ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 122.118.2.135

04/16 02:27, , 1F
annealing temp.再降點 或加5%的DMSO試試
04/16 02:27, 1F

04/16 12:11, , 2F
很好奇你primer的Tm value..
04/16 12:11, 2F

04/16 13:08, , 3F
合成的公司算的是70幾,但我並不是整段primer都會annealing
04/16 13:08, 3F

04/16 13:09, , 4F
所以Tm值是我另外算的
04/16 13:09, 4F

04/16 14:39, , 5F
先用taq試好條件再用pfu吧然後你東西都沒濃度只有體積
04/16 14:39, 5F

04/16 14:41, , 6F
這樣也不知道你加多少
04/16 14:41, 6F
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