Re: [討論] cloning
※ 引述《aaada (rex)》之銘言：
: ※ 引述《lblackpig (小黑豬)》之銘言：
: : 我使用PCR的方式將目標基因p出來，將PCR product由gel純化出來，再將其與T voector
: : 進行ligate，並進行transform。結果可以長出蠻多的colony。接下來想要將其clone到
: : pEGFP-N1，使用enzyme將T vector上的gene切下並elute出來，同時也使用相同的enzyme
: : 切pEGFP-N1
(不過可能兩個切點太近，只有約4-50 bp，所以gel上並看不出
被切下來的band，也不太確定有沒有切開）
針對這點 要不要查一下NEB的書
1. 看哪一個enzyme先切比較好
因為有的enzyme會需要旁邊有n個nucleotide才切的動
2. 使用buffer濃度低的enzyme先切
將兩者放在一起liagte，之後進行transform。
但是長出來的colony非常少，或者完全沒有，
(酵素切完應該有clean up 才做ligation齁?)
如同a大說的 抗生素有用對嗎
若有用對 那你得到的colony應該就是你要的
否則就是 你的vector或insert沒製作好 或是 ligation 條件不佳...
(酵素切完應該有clean up 才做ligation齁?)
不管我的基因是600bp或1600bp，都是這樣，各
: : 位有沒有任何看法？為何這樣的liagtion似乎好像效率不高？
: 有幾各可能 你參考看看
: 先決條件是 vector and insert處理都沒有問題
: 1.抗生素是否使用正確, pEGFP 記得是抗 kanamycin,不是常使用的Amp
: 2.competent cell efficiency太低, 多挑幾各或許可以挑到,
: 或是換好一點的 competent cell
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