Re: [求救] real time PCR variation 很大(同sample)
我算了一下妳的primer
self dimer, cross dimmer ,hairpin都沒什麼問題（或者說真的還不錯）
primer濃度稍微高了點
妳的濃度是400 nM final con.
ABI的建議在100~300 nM...這個部分可以試著降低點
And 妳是用SYBR Green嗎？
如果有附產物可以在Dissociation curve中看到多個山峰
※ 引述《apoptosis (good job)》之銘言：
: 謝謝大家推文回應 下面是回應推文的問題
: 我們實驗室只有我一個人做 很多東西我都不太懂 請教一下前輩
: 1. 我不知道怎麼作melting curve 稍微看了一下 好像是在amplify之後
: 請問軟件上面是否就有內建的程式可以跑 我用的是SDS2.0
: 2. 我的primer是別人設計的
: GCGTTCGGCACGGTGTATAA GGCTTTCGGAGATGTTGCTTC
: 昨天用beacon designer run了一下 發現是poor =而且有很多dimer
: 我發現dimer有一個量化的數delta G 一般介於0到-2 之間 如果沒有dimer的話是0
: 我還不太知道那個值有什麼意義
: 我準備定一對沒有dimer的primer試試看
: 3. 50 bp的確是比較模糊的一條band 但還是滿亮的
: 我準備把primer 降低一倍再試一次
: (原本是10uM primer 取1 ul mixture in 25ul total)
: 4. 我用的機器是ABI7900
: 謝謝大家
: ※ 引述《apoptosis (good job)》之銘言：
: : 最近作real time遇到困難
: : 我的問題是這樣
: : 1.primer + mixture 也有大約20~30 cycle, 我懷疑污染 就去跑膠
: : run gel發現有加cDNA的有兩條BAND,
: : 一條在100bp 是我的產物 另一條在約50bp 我懷疑是primer dimer.
: : 如果不加cDNA 就沒有100bp那條 只有50bp
: : 現在不知道要怎辦 只能redesign primer嗎?
: : 如下圖
: : M cDNA+primer primer only
: : 一
: : 一
: : 一
: : 一
: : 一
: : 一 一
: : 一 一
: : 2.我的variation非常大 大概會有3~5個cycle(同一個sample)
: : 不知道是不是就是primer dimer造成的.
: : 現在一頭霧水 請教大家 謝謝
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夜生活不只是一種生活，更是一種態度，音樂有很多類型，夜店有很多種類
喜歡與否只是一種偏好，卻不代表全部的選擇，夜生活的多樣與多變應該是
讓人有更多更廣的眼光看生活與體驗.........
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◆ From: 140.109.40.140
推
03/20 16:19, , 1F
03/20 16:19, 1F
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