Re: [求救] real time PCR variation 很大(同sample)
謝謝大家推文回應 下面是回應推文的問題
我們實驗室只有我一個人做 很多東西我都不太懂 請教一下前輩
1. 我不知道怎麼作melting curve 稍微看了一下 好像是在amplify之後
請問軟件上面是否就有內建的程式可以跑 我用的是SDS2.0
2. 我的primer是別人設計的
GCGTTCGGCACGGTGTATAA GGCTTTCGGAGATGTTGCTTC
昨天用beacon designer run了一下 發現是poor =而且有很多dimer
我發現dimer有一個量化的數delta G 一般介於0到-2 之間 如果沒有dimer的話是0
我還不太知道那個值有什麼意義
我準備定一對沒有dimer的primer試試看
3. 50 bp的確是比較模糊的一條band 但還是滿亮的
我準備把primer 降低一倍再試一次
(原本是10uM primer 取1 ul mixture in 25ul total)
4. 我用的機器是ABI7900
謝謝大家
※ 引述《apoptosis (good job)》之銘言：
: 最近作real time遇到困難
: 我的問題是這樣
: 1.primer + mixture 也有大約20~30 cycle, 我懷疑污染 就去跑膠
: run gel發現有加cDNA的有兩條BAND,
: 一條在100bp 是我的產物 另一條在約50bp 我懷疑是primer dimer.
: 如果不加cDNA 就沒有100bp那條 只有50bp
: 現在不知道要怎辦 只能redesign primer嗎?
: 如下圖
: M cDNA+primer primer only
: 一
: 一
: 一
: 一
: 一
: 一 一
: 一 一
: 2.我的variation非常大 大概會有3~5個cycle(同一個sample)
: 不知道是不是就是primer dimer造成的.
: 現在一頭霧水 請教大家 謝謝
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※ 編輯: apoptosis 來自: 76.182.57.0 (03/20 11:50)
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