Re: [求救] 蛋白純化imidazole的濃度
Hi,
1. Add 0.5% triton X-100 into the binding buffer. It reduces the
non-specific binding to some degree.
2. Try to pass the eluate through various ion-exchange chromatography
columns (e.g. DEAE column, Q column, and see what happens.
3. Add different tags to the protein (flag, myc, etc) and use antibodies
to purify the protein.
Good luck!
※ 引述《ayinie (心力交瘁........)》之銘言：
: 我的蛋白是接在pET28b帶有6-His tag
: 使用Ni-NTA純化蛋白
: 之前使用Lysis 10mM/10ml、Wash 20mM/20ml、Elution 250mM/3ml
: 結果每次跑膠染comassie blue出來都會有兩條bands
: 一條在44kD是我的目標蛋白
: 一條在17kD不知是啥鬼
: 這兩條band染色結果是差不多粗
: 可是做Western以Anti-His去認的話可發現17kD那條band非常非常地淡
: 怎麼看都不太可能是我的蛋白斷掉的片段
: 想請教的是...
: 會不會是因為我在純化的過程imidazole濃度跳太多(20mM→250mM)？
: 我現在想試試看改成10mM、20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM
: 那麼50mM、100mM、150mM、200mM這些的體積分別要加多少比較好？
: 謝謝！
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