[求救] 蛋白純化imidazole的濃度

看板Biotech作者 (心力交瘁........)時間16年前 (2008/03/07 20:43), 編輯推噓7(7推 0噓 10→)
留言17則, 5人參與, 最新討論串1/3 (看更多)
我的蛋白是接在pET28b帶有6-His tag 使用Ni-NTA純化蛋白 之前使用Lysis 10mM/10ml、Wash 20mM/20ml、Elution 250mM/3ml 結果每次跑膠染comassie blue出來都會有兩條bands 一條在44kD是我的目標蛋白 一條在17kD不知是啥鬼 這兩條band染色結果是差不多粗 可是做Western以Anti-His去認的話可發現17kD那條band非常非常地淡 怎麼看都不太可能是我的蛋白斷掉的片段 想請教的是... 會不會是因為我在純化的過程imidazole濃度跳太多(20mM→250mM)？ 我現在想試試看改成10mM、20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM 那麼50mM、100mM、150mM、200mM這些的體積分別要加多少比較好？ 謝謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.117.178
推
03/08 07:54, , 1F
有這麼不純嗎?分這麼多梯階還滿麻煩的..配藥麻煩
03/08 07:54, 1F
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03/08 07:55, , 2F
我的建議是..你用20 40 80mM做wash elution一樣250mM
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我經驗是100mM以上差不多都流光了啦..100~250這邊分梯階
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好像有點沒意義..不過純化都是case by case..
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03/08 07:57, , 5F
你喜歡的話也可以試試..體積的話就wash的以2倍到4倍
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03/08 07:58, , 6F
column體積..elution就1倍或0.5倍column體積
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推
03/08 08:00, , 7F
還有..假如只有這兩條band的話..其實你可以用透析膜
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03/08 08:00, , 8F
直接分開他們..他們大小還算差滿多的..用透析膜分離他們
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03/08 11:59, , 9F
透析膜的分離效率並不是很好喔 通常會流過但是過很慢
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03/08 15:07, , 10F
問一下..17KD的蛋白會通過一般透析模嗎?
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還是說要用孔較大的透析模呢? 謝謝唷..
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03/08 15:12, , 12F
對了想到~我的host cell Novablue也在17KD有東西..
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03/08 20:22, , 13F
那一條17kDa不知道會不會是非專一性的binding
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03/08 20:24, , 14F
在你的wash buffer裡 加一點NaCl 搞不好可以洗掉
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濃度可以用個150mM or 300mM 我個人是有用到500mM
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03/08 20:25, , 16F
不過要看你對你的蛋白有沒有什麼影響 case by case
03/08 20:25, 16F
推
03/09 10:53, , 17F
如果用AMYCON之類的東西分開勒
03/09 10:53, 17F
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文章代碼(AID): #17qJY6-d (Biotech)
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