Re: [求救] transformation的問題
不好意思我不是很懂您的問題所以可能有風牛馬不相及的可能
不過我想您的transform不成功的原因很有可能是
1.您確定您的inserte在回收後夠濃嗎?
在UV燈下切gel時盡量不要太久 我學長是說太久的話會不好ligation XD
我不清楚版上各位回收這種小片段的DNA時會如何處理 不過我的經驗是
我們實驗室的kit只要低於500bp的DNA就不好回收 因此我會採取將elute的產物
重複拿來elute的動作來弄濃(包含加熱) 不過缺點是可能導是DNA的斷裂而不好ligased
2.您的double digestion作的時間適合嗎?
其實現自我都會盡量避免不是和的double digestion 我的經驗是如果兩種酵素有可能
over digestion納反易繩間依該盡量不要超過1hr 即使如此仍有可能因為酵素亂切
而讓ligation更不易 (不要浪費自己時間阿 > <)
3.您的vector似乎很大 那有確定有切乾淨嗎?
我以前經驗 若我當vector很大時 而我的酵素切位很近 那我會盡量不用over digestion
而先以低鹽的酵素切(可以切久確定有切乾淨) 然後再藉由加熱去活性 再加大體積到
高鹽的酵素理切(我印象中很像低鹽以及低PH都會讓酵素over digest)
盡量避免over digest 我的經驗中over digestion是ligation失敗的重要原因之一
另外 這步驟是要你確定有切乾淨 不然到時您轉殖出來都是vector的菌
中間會浪費好多寶貴的時間 有些東西一下沒法想到 不過原則是
1.DNA要夠濃 即使是vector也不能太淡 不用擔心ligase會被鹽類影響作用
我試過即使我ligation時不補水也能ligase得不錯
2.不能over digestion 但你要能確定你有切乾淨
3.你的competent cell效果要好:)
祝您順利唷^^
(P.s這是個專題生的小小經驗 如有誤請多多鞭撻XD)
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