Re: [問題] western blot 壓片的問題..
※ 引述《threestars (等待)》之銘言：
: ※ 引述《linker0726 (試著獨立)》之銘言：
: : 今天壓片子的時候，perk的訊號很強..壓了5秒就很黑了
: : 但是erk的壓了20分鐘完全沒有東西...
: : 請問是哪裡出錯了....之前有成功壓出來過...
: : erk的濃度是1:1000...
: : 感謝
: 最近一直在押 ERK
: 你問的是protein的ERK1/2 還是phospho-ERK
: ERK量比較少本來是要壓久一點 但20分鐘好像太久了
: 你的ECL有稀釋嗎？
: ERK 1：1000算滿濃的 如果還出不來 你可能要檢查一下是不是1抗或2抗壞掉
: 抗體加入blocking buffer時 buffer溫度太高也不行
: 如果是phospho-ERK 又比ERK弱
: 我之前ERK和phospho-ERK 都用Santa Cruz
: ERK還OK phospho-ERK有夠糟糕 壓了兩個月 看的到band
: 但雜band一堆 要不就是背景直很髒
: 就像之前版友講的 一樣狀況 聖誕牌很糟糕
: 跟老闆講又不太相信 一直叫我試條件
: 直到有其他老師跟他講說聖誕牌的會這樣他才相信
: （好像是跟抗體不同批號有時候會出現特好或特壞的狀況）
: 最近換cell signaling 一下就出來拉 漂漂亮亮
嗯嗯...其實我是新手..這是第二次自己跑western blot..
請問一些很基本的問題..我怕我是不是記錯了...
ERK還是phospho-ERK的訊號哪個比較強阿...我有點搞混了...只記得壓第一片時螢光很
明顯.壓了一秒BAND就很漂亮了..我記得這個是ERK吧..(也就是說我第一篇文打錯了..)
應該是phospho-ERK壓不出來 (這個比較難出來???)
另外.昨天有跟老師討論，他說有可能是我加2抗的時候，用MILK當稀釋關係...
可是之前學長姐說加MILK會讓背景比較乾淨...
於是我昨天跑今天壓了一片..可是不用MILK稀釋2抗..改用PBS 1X稀釋...
是有跑出點東西了..但雜BAND還滿多的...還跑出來不是預期的BAND Orz
等會再問看看我們家是不是用聖誕牌的 = =
好像是...不過在確定一次
因為之前有換過一次抗體..但壓出來...band爆多的= = 幾乎每個不同的kD都跑出來..
專一性有點問題..就退掉了..所以現在我也不知道是用什麼牌子的
先在問看看囉...
還有..用PBS會不會干擾phospho-ERK阿? 都有磷酸....
你都用什麼稀釋阿??
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◆ From: 125.228.149.230
推
07/21 12:04, , 1F
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