Re: [問題] 關於細胞內自由態鈣離子測定之實驗問題
※ 引述《Channels@kkcity.com.tw ( )》之銘言:
: 加入螢光探測劑 Fluo-3 AM 之後需要等待一段時間,其原因首先是要讓 Fluo-3 AM 穿透細胞膜,其次如你所說,要等待細胞內酵素將 Fluo-3 AM 轉變為非通透性之 Fluo-3。
: 再來,我想你誤解了整個實驗的原理。
: 一、你測的是 Fluo-3 在波長 530 nm 的發光值 (emission light intensity) 而非吸光值。該發光值與鈣離子濃度成正相關,因此可以作為細胞內鈣離子的指標。
: 二、另兩管之目的是在做校正,以便求出正確的鈣離子濃度。
: Fmax 那管加入 ionomycin 及 CaCl2,讓細胞膜通透大量鈣離子,所以此時測到的發光值係最大值 (maximum),代表大量鈣進入細胞時,Fluo-3 螢光的飽和值。
: 相反地,Fmin 那管加入 ionomycin 及 EDTA,讓細胞內鈣離子流失被螯合劑 EDTA 清除掉,所以此時測到的發光值係最小值 (minimum),代表無鈣存在時, Fluo-3 螢光的背景值。
: 從以上定義就知道,你們測得的數據沒有問題。接著再利用 Fmax, Fmin 兩個校正點,將 F 值代入公式(請見廠商說明)可以內插算出待測樣品細胞之鈣離子濃度。
: 最後再請問你,你是用何種機器做這個實驗?
謝謝您做的解答~網路上找那麼久~發現還是有個人教比較不會出錯...
另外我們用的是fluorescence spectrophotometer(螢光分光光度計)
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