Re: 大家看看吧
※ 引述《RoarING (創下我的經典)》之銘言：
: ※ 引述《afa》之銘言：
: : 作者: afa (我是可愛的馬鈴薯) 看板: NTUAC92
: : 標題: 大家看看吧
: : 時間: Sun Jan 11 01:09:08 2004
: : 作者: afa (我是可愛的馬鈴薯) 看板: NTUBST92
: : 標題: 通緝清河!!
: : 時間: Sun Jan 11 01:02:25 2004
: : 抱歉..借用系版一下^^"
: : ---
: : 清河 假如你還在線上的話...
: : 你可不可以幫我看一下這個..
: : ----
: : Direct sequencing的目的如下..
: : 為了要了解無法在實驗室中培養的細菌，利用此技術配合演化樹，尋找此種細菌
: : 與目前已知的哪些細菌相似..
: : [稍微翻一下而已啦..有一點錯的話不要太計較^^"]
: : Direct sequencing的流程如下..
: : 1.從土壤或水中取sample
: : 2.將細胞溶解&作DNA purify
: : 3.用"廣泛的"(universe)rRNA基因的primer 將purify後的DNA作PCR
: : 4.將PCR後的DNA purify後並分類
: : 5.將分類後的DNA分別注入E.Coli中
: : 6.待E.Coli大量繁殖後 取出plasmid再跑電泳
: : 問題如下..
: : 1.第4步時的purify是不是要將製造rRNA基因特別分離出來?不然為什麼要再purify一次..?
: : [我真的忘了耶..PCR後要再作一次purify嗎?]
: 我的想法阿 第二步的purify是把DNA跟其他細胞質的東西分離
yep!
: 而在第四步的purify是分離出不同的片段
因為你在做PCR的時候
除了你的DNA之外 你還要放引子 聚合酉每...等東西
所以還是要purify一下啦..
[我之前完全忘了這件事情...||]
另外..分離出不同的片段
應該是用"電泳"來分離
: : 2.為什麼要特別將這段DNA放入E.Coli裡面??用意是什麼??
: : 假如只是要放大DNA的話..直接用PCR跑就好啦 跑多久就有多少..
: : 是因為PCR的錯誤率高?[好像有聽說過這件事..但是我不確定..>"<]
: : 我想了很久耶..>"< 可是還是不會><"
: 我記得...做PCR的時候 要放入人工的引子 才能開啟複製叉 進行複製
: 所以...PCR複製一遍的量 好像是有限的 就是一次只能複製你所給引子的量的DNA
: 所以用PCR跑到一定量的DNA之後 再分離 放進大腸桿菌之後
: 大腸桿菌繁殖的速度很快 不用很久的時間就可以有很大一缸的DNA可以用了吧
: 嗯...這是我的猜測啦 哈哈 不知道對不對
嗯..大家對PCR的印象好像都覺得很複雜..
可是其實不是這樣的喔~~
你只要放入一定量的引子
然後對著機器調整你要的cycle數
等2-3hrs 結果就出來了!
可是你假如要對大腸桿菌作clone的話..
是一件非常麻煩的事情...||
你把DNA注入後 要先經過篩選[例如用抗生素]
然後呢..養菌給你養個半天好了..
最後還要抽plasmid
我想最快要.........一天吧 可能不只..
光時間就差很多
: : ---
: : purify應該是一定要的..因為要把雜質弄掉..我後來才想起來..
: : [我們做完PCR應該有做purify吧..我真的忘了..||]
: : 第二個問題呢..強者董認為PCR的確錯誤率比較高
: : 不知你有什麼看法??
: : ---
: : 歡迎大家一起討論~~
: 不過我沒聽過說PCR錯誤率比較高這件事ㄝ..求証之後告訴我一聲好嗎
: 拜託啦 謝謝 多學一課
這個呢..
在PCR的技術還沒有這麼成熟的時候 是真的!!
不過現在已經不會了啦~~
至於我朋友去查資料的結果..
簡單講就是,之所以去作clone,是因為不相信PCR的結果
所以將這兩個結果(只作PCR和clone)的sequencing結果作比對
結論是PCR可以信任,所以後來漸漸不作clone
只是我們的課本還是有這個步驟就是了..
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I'm just a small potato.
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