Re: [請益] [生化實]請問大家收蛋白質要作western …
真是感謝您詳細的解說
我目前的情況是這樣：
我想看的蛋白是p-proteins
所以lysis buffer裡面含有phosphatase inhibitor是可以接受的
但是我想看的pathway裡頭有 PP2A 而且他是在蠻上游的地方
所以我才會想到 phosphatase inhibitor會不會把PP2A給抑制掉
造成PP2A下游的蛋白表現受影響?
學長跟我說這是一個切面的問題 收蛋白時lysis buffer把所有反應都停止
這只是一個切面 而不會影響整條pathway
但我還是愚鈍 有點想不通?
※ 引述《biolenz (lenz)》之銘言：
: ※ 引述《metalbi (真有趣)》之銘言：
: : 收蛋白的步驟用的buffer有哪些
: : 我的方法有兩種
: : ㄧ種是用sampling buffer
: : 另依種是除了sampling buffer以外還有lysis buffer
: : 請問這兩種萃取法有差嗎??
: : 因為我查了我們實驗室的lysis buffer的配方
: : 裡面竟然還有phosphatase inhibitor
: : 不知道是否會將蛋白質的phosphatase都抑制掉了
: : 這樣對於實驗結果會有差耶!!
: : 煩請大家解答
: 收蛋白 (萃取蛋白) 首先要看你是用什麼細胞，
: 植物跟動物跟細菌都不太一樣。
: 所謂 lysis buffer 裡頭可能含有一些 detergent 或是 enzyme
: 前者打破細胞膜，後者打破細胞壁 (像植物或是細菌)
: 至於 buffer 系統，PBS、Tris、Tricine、HEPES 很多種，
: 除非特別用途，否則都差不多，就看習慣了。
: 小結一下，lysis buffer 裡頭含有
: 1. buffer system 主要維持 pH 穩定 (細胞內很多 pH 很極端的胞器)
: 2. protease inhibitor (防止蛋白質被分解)
: 3. phosphatase inhibitor (防止磷酸化的蛋白被分解，非必要，看實驗)
: 4. detergent (打破細胞膜，或是萃取膜蛋白)
: 有 ionic 與 non-ionic 的兩種，前者常用如 Triton X-100、NP-40
: 後者如 deoxycholate
: 5. enzyme (看要做啥就放啥，去 DNA 還是去掉特定蛋白，或是打破細胞壁)
: 說實在其實 lysis buffer 是個很廣義的名詞，只要以上的元素就算是，
: 至於元素怎麼選擇，每個實驗室甚至每次實驗可能都不一樣。
: 另外你所謂 sampling buffer 我想應該就是 sample buffer，
: 這個定義跟配方就比較統一了。
: Sample buffer 又稱為 Laemmli buffer，是 1970 年發在 Nature
: 上的一篇文章其作者的名字。本篇作者發明了 SDS-PAGE，首度使用
: Stacking gel 跟 Running gel 的系統，配合上經過 sample buffer
: 處理的蛋白質樣品，可以得到很好的分離效果，我們現在用的方法，
: 就是那時候的，配方都沒有變過。
: 可參考如下：
: Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the
: assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–85.
: Sample buffer 裡頭一樣有 detergent (SDS)，有些人會直接拿這個
: buffer 來萃取蛋白質，不過因為 sample buffer 內含 glycerol
: (為了讓 loading 的時候蛋白質會沉在 well 裡)，整個黏呼呼的。
: 不一定適合所以萃取方式。
: 總結，反正要萃取蛋白質不外乎 buffer、protease inhibitor (必要)
: 另外再加 detergent，沒有 detergent 就用液態氮直接打破它。
: 其它加進去的，大多是實驗上有其他用途才會加。
: 所以建議你可以仔細想想你們實驗室的 protocol 都是拿來做什麼的，
: 或是問問學長姐比較快喔。
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