[求救] HEK293T IFA 問題及改善方法

看板Biotech作者 (CY)時間5年前 (2019/03/21 18:07), 編輯推噓7(7推 0噓 13→)
留言20則, 5人參與, 4年前最新討論串1/2 (看更多)
(手機排版) 嗚嗚嗚嗚嗚嗚嗚嗚 先感謝點進來的大大們 小妹壓力爆棚快往生了 老闆一直覺得為啥核比較大顆 (??) 為什麼沒辦法染出mitochondira 均勻分佈在細胞的樣子，老闆說要看到均勻分佈的美圖呀QQ 本lab目前沒有存在做過的人，小妹我也是自己摸索試看看，無人能討論故求板上大神們解救一下嗚嗚 以下為小妹做的方式 免疫螢光染色 1. 種細胞 取2.5 ×105 cell/well transfected 好的HEK293T cell 種於24mm圓玻片上培養16小時，去除上清液，wash PBS 2次，加入混有200nM Mitotracker的medium 培養40分鐘 2. 固定細胞 以medium 混好的3.7% Paraformaldehyde 固定細胞 15 min 後wash PBS 兩次 3. 細胞打洞 配置pernibilization buffer : 0.25% Triton X-100 加入Well內5 min 4. Blocking 配置blocking buffer 1% BSA，以最低rpm於常溫搖晃1小時， 再用PBS buffer wash 3次 5. 加入1o Ab (1:250) 作用O/N 隔天用PBS wash 2次 6. 加入2o Ab Goat anti-rabbit 488 (1:250) 以最低rpm搖1小時，再用PBS wash 2次 7. 取出玻片滴上含有DAPI封片膠後蓋於載玻片上周圍塗上指甲油固定封片 然後使用Confocal (ZEISS LSM700) 拍的 我有乖乖做Z-stack QAQ... 每次做到加triton時細胞都給我飄起來說hello.. (改0.1%也是) 我已經非常非常非常小心的加任何試劑了QQ… 我要怎麼做出細胞貼的好好，然後mitochondira均勻分佈的美圖咧QAQ 大大們可以幫小妹做個檢討嗎TAT 以下圖檔: 紅色：Mitotracker >>MitoTracker™ Red CMXRos (Thermo) 綠色：目標protein 藍色：DAPI http://i.imgur.com/zDygmBc.jpg
謝謝!!!!!!!! ----- Sent from JPTT on my Samsung SM-J700F. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.217.251.191 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1553162835.A.FEA.html
推
03/21 20:36, 5年前 , 1F
玻片有先摳嗎
03/21 20:36, 1F
推
03/21 21:30, 5年前 , 2F
1. 293非常會飄，試試看玻片用 0.01%PLL摳一小時,他會
03/21 21:30, 2F
→
03/21 21:30, 5年前 , 3F
貼的比較好，自然不易被沖下來。
03/21 21:30, 3F
→
03/21 21:30, 5年前 , 4F
2. formaldehyde會用 PBS 之類的 bfr 稀釋吧？ 滲透壓
03/21 21:30, 4F
→
03/21 21:30, 5年前 , 5F
過高也會影響 fixation過劇而皺縮。
03/21 21:30, 5F
推
03/21 21:41, 5年前 , 6F
後來查了 mitotracker的建議，上述第二點就忽略吧! 可
03/21 21:41, 6F
→
03/21 21:41, 5年前 , 7F
以從第一點改善
03/21 21:41, 7F
推
03/21 22:59, 5年前 , 8F
小弟跟動物細胞不熟, 2 formaldehyde的medium裡是有fb
03/21 22:59, 8F
→
03/21 22:59, 5年前 , 9F
s的嗎?
03/21 22:59, 9F
推
03/25 20:52, 5年前 , 10F
formaldehyde是拿來固定細胞的，有沒有fbs好像沒啥關係
03/25 20:52, 10F
→
03/25 20:52, 5年前 , 11F
？
03/25 20:52, 11F
推
04/26 07:37, 5年前 , 12F
我自己的經驗是，雖然mitotrcke「號稱」對細胞沒有毒
04/26 07:37, 12F
→
04/26 07:38, 5年前 , 13F
性，但事實上卻因細胞而異，我記得tracker也可以死染
04/26 07:38, 13F
→
04/26 07:38, 5年前 , 14F
（自己查一下），可以改成固定後跟抗體一起染，或者
04/26 07:38, 14F
→
04/26 07:38, 5年前 , 15F
改用抗體抓粒線體，這樣圖會美一點，粒線體也較於呈現
04/26 07:38, 15F
→
04/26 07:38, 5年前 , 16F
它原本的形狀。另外「粒線體均勻分佈在細胞中」，欸
04/26 07:38, 16F
→
04/26 07:38, 5年前 , 17F
抖...有的細胞的粒線體是圍在細胞核附近的，你要不要
04/26 07:38, 17F
推
06/14 22:08, 4年前 , 18F
換細胞株做，293易漂，沒漂也容易在加入試劑時變圓，當然
06/14 22:08, 18F
→
06/14 22:08, 4年前 , 19F
細胞質區域就變少不容易觀察，若非得用293,那就先用poly-l
06/14 22:08, 19F
→
06/14 22:08, 4年前 , 20F
ysine coating試試
06/14 22:08, 20F
‣ 更多 IFN113 的文章
文章代碼(AID): #1Sas9J_g (Biotech)
‣ 更多 IFN113 的文章
文章代碼(AID): #1Sas9J_g (Biotech)