[求救] site-directed mutagenesis
最近在做A基因靠近3端不足100bp的點突變,
primer設計如下:
F -----m----------->
5' ------------------------------------------------------3'
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------
<------------m----- R
Forword primer長度30bp
Reverse primer長度32bp，m為突變位置，兩條primer中間overlap 10bp，
Tm值都大約60、61左右，
目標為6.6kb左右的plasmid，但我一直都P不出來。
PCR材料照phusion產品說明的:
ddH2O add to 20ul
5X Phusion HF buffer 4ul
10mM dNTPs 0.4ul
Forward primer 1ul
Reverse primer 1ul (primer final concentraction 0.5uM)
template 1ul
3% DMSO 0.6ul
phusion 0.2ul
__________________________________________
total volumn 20ul
PCR condition:
98℃ 30s __
98℃ 10s |
55℃ 30s | 25cycle
72℃ 3min20s _|
72℃ 5min
25℃ ∞
template有試過放不同量0.1ng、1ng、5ng、10ng，有加DMSO or 沒加，
但PCR一直都跑不出來，
後來有試著用DpnI digest後再拿去transform看看，有長colony，但都萃不到質體。
之前在文獻有看到有人說靠近3端的點突變不能直接做，
那篇是用兩條延伸到plasmid的primer做，接著進行融合PCR，最後在clone回質體，
不知道這會不會是p不出來的原因?
(可是plasmid不是圓的嗎?問了實驗室有在做的人都覺得這說法不太合理)
因為之前沒經驗，問了實驗室的人才知道他們都是用complement priemr做，
目前想到的就是重訂primer，
不知道版友對於這個情況有沒有什麼建議?
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