Re: [方法] drug-resistant cell line消失

看板Biotech作者時間6年前 (2017/08/14 18:59), 6年前編輯推噓2(2推 0噓 13→)
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※ 引述《GanLinBa (Fait votre père)》之銘言： : 我們實驗室有篩選出來的gemcitabine-resistant cell line : 我想問 在maintain cell line 時我們會加drug : 1. : 但如果要單純比較parental vs gemcitabine-resistant cell line在不同環境 : 例如starvation vs hypoxia vs FBS的某個protein表現 : 做實驗有需要加gemcitabine嗎? : 老闆說因為這個是篩選出來的 : 所以就像stable cell line 做實驗不需要加gemcitabine : 2.在gemcitabine-resistant cell line 想看某個gene是不是對於resistance很重要 : 所以我就利用gemcitabine-resistant cell line去用virus knock down實驗後 : 加puromycin去篩選 請問這時需要也加gemcitabine一起去篩選嗎? : 如果puromycin+gemcitabine 可是這樣篩會不會導致引起其他gene誘發resistance? : 感謝 Drug-resistant細胞株在maintain時當然會持續加藥 可是在操作實驗時加藥的目的是什麼？ 大多數drug-resistant (Gem-R)都是跟parental或sensitive (Gem-S)比較 如果前者加藥後者沒加，兩株不同的培養條件怎麼比呢 舉個一定面臨的例子 馴化一株Gem-R細胞(gem 20nM)後，要畫AUC或IC50 curve 如果Gem-S是用0, 1, 2, 5, 10, 20nM處理72小時看survival 那Gem-R是要用(a) 0, 1, 2, 5, 10, 20nM 還是選(b) 20, 21, 22, 25, 30, 40nM？ 驗證survival時都可以withdraw gemcitabine來比較兩株細胞的反應了 那添加stimuli是不是也該如此， 才能比較Gem-S與Gem-R的反應要無不同？ 至於第二個問題，你想用shRNA關掉某個基因後觀察Gem-R變成Gem-S 藉此找出導致Gem-R的關鍵基因吧 如果真的照建議說的用puro + gem，那Gem-S還會讓你篩到嗎？ 想也知道有意義的clone都因為加了gem死光了阿 你只會篩到一堆帶有puro-R的Gem-R 以tamoxifen為例，第二個問題就有不少是先用microarray或RNAseq找出DEG 再針對個別candidate進行transient knockdown，即可用IC50看出有無效果 不必花時間用shRNA pool去建立個別的stable clones -- ※ 編輯: blence (223.136.39.2), 08/14/2017 19:16:44
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1. 選B 因為Gem-R應該對20nM以下無反應 如果要看
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survival 相對於paerental 應該會選B
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"Gem-R應該對20nM以下無反應"， 換言之，Gem-S對於20nM以內即有反應，不是嗎？ 這句話需要證明，所以你當然要用A證明 我先舉以下的例子了 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145985 (Figure S1) 換你來找找看有沒有圖會用不同dosage interval來驗證Gem-R與Gem-S不同的例子
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2. 所以在knockdown完後 maintain細胞就只要加puromycin
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然後做實驗時 再用gemcitabine去跟Gem-R-shLuc去做
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virus knockdown我都是用pool 只是maintanin時
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我認為是只要puromcyin去maintain這株Gem-R-shX gene
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但因為我實驗室學姐說也要加Gemcitabine去maintanin
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如果我對你的話有理解錯誤 請指正
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所以你學姊要用Gemcitabine來maintain Gem-S (Gem-R shRNAs_kd) cell lines 我有誤解嗎？ 如果是，只能祝你好運了 ※ 編輯: blence (180.218.151.4), 08/14/2017 20:59:29
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學姊建議是Gem+Puro 而我是想應該是Puro就好
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所以答案是maintain只要puro?
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加Gem怎麼篩得出sensitive的clone? 就死掉了阿
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推
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選A，這就跟stable cell line是不一樣的東西惹，之
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前完全用錯概念
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當以sh-geneX跟sh-luc分別做成stable clones時 研究組與對照組都有持續用puro培養 毫無疑問的，兩組都可以一直加puro進行各種實驗 drug-resistant cell line的馴化則是將研究組持續3~12個月的藥篩 但對照組會用DMSO或EtOH等(前者的溶劑)培養相同時間 故進行各種實驗時，研究/對照組就會回到parental的培養環境(withdraw drug) 所以選A才符合研究組與對照組的基礎 ※ 編輯: blence (180.218.151.4), 08/15/2017 09:23:16
推
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這樣篩出來的要叫啥XD 我用Gem篩出Gem sensitive
08/15 09:23, 15F
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