[求救] PCR 結果一直不理想或沒東西

看板Biotech作者 (請叫我雞頭!)時間7年前 (2017/02/16 13:49), 7年前編輯推噓7(7推 0噓 18→)
留言25則, 8人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
各問前被大大們好 目前被交代要做Genome typing 事情是這樣的，LAB中有2批小鼠的染色體上，分別帶有人類某A或某B gene的DNA →cDNA的形式(沒intron)，而且是homozygous 也就是A這批小鼠身上某條染色體上帶了A gene B這批帶了B gene -------------------------當然，這是廠商給的訊息-------------------------- 那麼我現在要用PCR的方式去放大這個A gene 或B gene 由於A B兩者相似度很高 所以在抽出老鼠的genomic DNA之後，跑PCR要送sanger定序 問題來了，設計的primer包含reverse 和forward都有確定可以夾到這兩個gene 但PCR出來的結果(2% agarose)，要不看不到東西，就是不亮 ※我有夾這個gene的plasmid作為確認產物大小的control A B gene大概長這樣 → 111111111111111aaaaaaaaaaaaaa222222222222222222 兩者中間大概有400bp左右是差異度比較高的，頭尾幾乎一樣，總長大約1500bp 而primer是從頭到尾都夾 taq：Qiagen Multiplex PCR Kit 在加入kit中的Q-solution(據說明是增加產物專一度)前，可以跑出淡淡的band 但在加了Q之後卻跑不出東西來了，應該說讓negetive跑出東西來而且跟有+DNA的一樣亮 Genomic DNA 的量有用過10/50/100 ng 總體積都是25uL 結果都一樣 我想問我要怎麼改變條件，才能讓我的主產物更亮 才好用gel extraction後有夠濃的DNA送定序 PCR的溫度及時間： 淡淡band的一次 (拿別人用別的taq做的條件) 95-- 3min 95--30sec ─┐ 58--30sec 35 cycle 72-- 1min ─┘ 72-- 5min 依照我的taq修改...產物有band(不很亮)，但也出現其他不是產物的band 所以...實驗室有人建議加Q-solution試試 95--15min 95--30sec─┐ 58-- 1min 45cycle 72--30sec─┘ 72--15min 加Q-solution後，就沒東西了... 95--15min 95--30sec─┐ 58--1.5min 55cycle 72--60sec─┘ 72--10min -- 推 CCC：問：現在房間只有2.9度，請問這樣的情況會不會下雪... 推 CCY：不會！牆角還有90度！ → CCC：請問90度是華氏還是攝氏~ 推 SBY：是a平方+b平方=c平方 推 WCC：所以躺在地上應該有180度?! 推 HKS：對~轉一圈有360度~~多轉幾圈要幾度有幾度(((喂~~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.49.19 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1487224194.A.055.html ※ 編輯: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 13:50:43 ※ 編輯: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 13:51:32
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02/16 14:12, , 1F
如果primer是1.5kb重頭到尾都夾,那2% agarose以及30sec的
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extension就不是合理的條件
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02/16 14:14, , 3F
這些在你用的Qiagen Multiplex PCR handbook也會有建議
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B大，我重新補充了我試過的條件，我是打算回去用第二組不加Q-solution的 但還是想讓主產物再更多 其他不是產物的band反正我可以切膠切掉這OK，有好建議嗎？ ※ 編輯: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 14:36:01 目前我的想法除了回到第二組的條件外(不加Q-solution) 就是拿跑過PCR的這些，拿一些出來再用相同的primer相同的condition再跑一次 (有番到某篇"增加PCR產物"的文) 但想到，若要做定序的話，好像要擔心複製出錯的問題？ 還是其實OK就跑跑看也送定序看看？ 目前我必須把這個條件確認下來，因為之後還有好幾隻老鼠要做確認 QAT ※ 編輯: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 14:53:14
推
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gradient PCR跟前後多設幾對primer 就醬
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推
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你的產物是1500 bp嗎 是的話72度那步1分鐘可能還不夠喔
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30s 500bp
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推
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72度C放長到1.5min
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p大e大 好的 ！
推
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跑到45跟55 cycle有點多欸 ...
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02/16 17:40, , 9F
primer anealing 溫度跑gradient 72度C 改1.5 min
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並不是愈多Cycle就會愈好喔..
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Cycle 數確實我只是想增加產物，handbook是建議30~45cycle
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02/16 17:41, , 11F
另外你只是要genotyping的話應該不用考慮出錯率的問題
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推
02/16 17:49, , 12F
錯幾個base不會影響你判斷結果
02/16 17:49, 12F
OKOK 我會思考看看
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02/16 19:35, , 13F
我是覺得為什麼你寫的condition會跟handbook的差這麼多
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另外 幹嘛跑到2% 1.5K跑1%就很夠了吧
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02/16 19:37, , 15F
既然都購買優化過的kit了,改條件前也先參考default吧？
02/16 19:37, 15F
了解，我會以default+建議的annealing溫度重新來 thanks
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還有ng level的template跑超過35個cycle大概只會把你
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的產物燒壞...
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I大 handbook是建議30~45個cycle ... ※ 編輯: taya1991 (61.230.91.19), 02/16/2017 20:50:44
推
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對了 難道你不能去跟廠商要他們genotyping的method嗎？
02/16 21:00, 18F
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02/16 21:00, , 19F
說homo就真的homo @w@? jax的鼠兒嗎？
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我了解你的意思，but......事情沒這麼單純，有點複雜...痾...這應掰不方便公開說((? 恩...... 總之我會需要建立這套系統的~ ※ 編輯: taya1991 (61.230.91.19), 02/16/2017 22:14:22
推
02/16 23:22, , 20F
了解 =.,= 那只好教個秘招...用R牌的probemaster 跑PCR...
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02/16 23:22, , 21F
可能會有你要的片段大小 可惜含dUTP.. 如果有產物的話再
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想辦法跑nestPCR定中間片段
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02/17 00:12, , 23F
appendix C看一下好嗎
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02/18 11:19, , 24F
梯度PCR跑一次，找最佳黏合溫度看看。
02/18 11:19, 24F
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02/19 01:21, , 25F
Primer 大小？
02/19 01:21, 25F
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文章代碼(AID): #1OfJs21L (Biotech)
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