Re: [求救] Roche Southern DIG
※ 引述《joycenino (joycenino)》之銘言：
: 大家好:
: 想請教大家關於Southern DIG的實驗問題...
: 因為本實驗室尚無系統，我做了好幾次都只有marker跟positive control有雜合訊號..
: 我的材料是比較少人做的中草藥植物.."
: 用CTAB法抽取DNA
: 以下有幾個問題想請教大家..> <
: 1.植物gDNA的濃度 (這應該是最主要的問題..?)
: 我之前都是用O.D值測DNA的濃度，同時也會跑膠check
: 雖然我知道O.D.值沒那麼準...但還是用它估算約15 ug 的DNA
: 去切酵素
: 想問大家大概都拿多少的DNA去做southern dig
15ug!! 要想想酵素切不切的動，以前都拿2~3ug，甚至1ug就夠了
: 2.探針
: 想問大家做探針的方法，畢竟植物genome複雜，都會擔心探針效率好不好
: a. 說明書是寫把insert接到T-vector裡面，再用酵素切，跑膠回收片段
: 拿去做探針。但切膠回收感覺都會流失很多...這方法我還沒試過
: b. PCR產物直接以Kit純化，之前都是用這方法做探針
: 探針效率以說明書的方法測試，也是ok的
: c. PCR產物跑膠之後，切膠回收片段，這方法我也沒試過..
: 這三種哪種方法比較好...?
以前都是用PCR clean kit 直接回收片段當probe
要先跑膠確認size是否正確，通常 dig label 的片段會大一些，所以會準備
一個不加 dig 當 control(這個PCR product 可以留下來當以後製備probe的材料)
: 3.目前實驗室有兩組Kit
: DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I
: (Kit for color detection with NBT/BCIP)
: DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II
: (Kit for chemiluminescent detection with CSPD, ready-to use)
: 我知道是呈色方法不同，據廠商說是CSPD比較靈敏..
: 但我用CSPD也沒有成功過..
: 想問這兩組kit哪一組比較好，或是有做成功的人可分享一下經驗嗎?
: 我已經失敗到心灰意冷了> <
: 謝謝大家幫忙 及 耐心看完我的問題
你有提到positive control有signal，可是你的樣品都沒有，可能是
1) 樣品沒有你要的 insert，都用到15ug了，不至於看不到
2) Probe label dig 有成功，但不是你要的probe
這是我能想到的，還有大大可以補充嗎?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 119.14.37.171
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