[求救] Roche Southern DIG
大家好:
想請教大家關於Southern DIG的實驗問題...
因為本實驗室尚無系統，我做了好幾次都只有marker跟positive control有雜合訊號..
我的材料是比較少人做的中草藥植物.."
用CTAB法抽取DNA
以下有幾個問題想請教大家..> <
1.植物gDNA的濃度 (這應該是最主要的問題..?)
我之前都是用O.D值測DNA的濃度，同時也會跑膠check
雖然我知道O.D.值沒那麼準...但還是用它估算約15 ug 的DNA
去切酵素
想問大家大概都拿多少的DNA去做southern dig
2.探針
想問大家做探針的方法，畢竟植物genome複雜，都會擔心探針效率好不好
a. 說明書是寫把insert接到T-vector裡面，再用酵素切，跑膠回收片段
拿去做探針。但切膠回收感覺都會流失很多...這方法我還沒試過
b. PCR產物直接以Kit純化，之前都是用這方法做探針
探針效率以說明書的方法測試，也是ok的
c. PCR產物跑膠之後，切膠回收片段，這方法我也沒試過..
這三種哪種方法比較好...?
3.目前實驗室有兩組Kit
DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I
(Kit for color detection with NBT/BCIP)
DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II
(Kit for chemiluminescent detection with CSPD, ready-to use)
我知道是呈色方法不同，據廠商說是CSPD比較靈敏..
但我用CSPD也沒有成功過..
想問這兩組kit哪一組比較好，或是有做成功的人可分享一下經驗嗎?
我已經失敗到心灰意冷了> <
謝謝大家幫忙 及 耐心看完我的問題
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