[求救] 如何 PCR full-length cDNA?

看板Biotech作者 (以平凡創造奇蹟！)時間13年前 (2013/02/21 17:08), 編輯推噓2(2推 0噓 10→)
留言12則, 6人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
嘗試了很多次 但全長始終P不出來(3045 bps) 奇妙的是，之前再做其他實驗有P出這個gene的3'端fragment(768 bps) 但現在老師要求保險起見，想要看全長蛋白的表現 但是我始終P不出來，有可能是template cDNA已經斷光了嗎? 還是我的primer設計有問題呢? 我全長兩端primer設計如下： F-AAAGGATCCA"ATGAAGGTACCTGTATCCGGG" R-AAAGCGGCCGC"ATTCACAAACTCAATGTAATTTGCTG" " "內是與gene互黏的序列，" "以外則是切位跟多留的bps 我的PCR條件是 94度 30' 55度 30' 72度 3"10' 老師說可以嘗試分段PCR再接起來，可是我查過，上面的切位真的很稀少，而且很冷門 我到底該怎麼辦? -- 不要可憐自己，那是下等人做的事！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.25.86
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02/21 18:17, , 1F
兩條" "的序列拿去blast無法共同對應到同一gene,甚至疑似的
02/21 18:17, 1F
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02/21 18:18, , 2F
gene也不是3kpbs,是NCBI database不夠完整嗎？
02/21 18:18, 2F
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02/21 18:26, , 3F
如果沒切位要接也是可以blunt end接...但機率..XD
02/21 18:26, 3F
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02/21 18:28, , 4F
或者找找看有沒有TCTAGT這種 非單一enzyme的切位
02/21 18:28, 4F
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02/21 18:29, , 5F
TCTAGT可以一邊用XbaI一邊用SpeI接 我記還有其他這種序列
02/21 18:29, 5F
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02/21 18:31, , 6F
當然template也是問題..P長片段時抽RNA和轉cDNA品質都要好
02/21 18:31, 6F
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02/21 19:18, , 7F
有試過其他溫度PCR嗎?annealing temp 有點太高了...
02/21 19:18, 7F
推
02/21 20:14, , 8F
用overlap PCR, 分段p出, 再PCR接起.
02/21 20:14, 8F
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02/22 12:07, , 9F
請問樓上的前輩，是先分段overlap分段P出來之後，再把
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02/22 12:08, , 10F
P出來的產物都加到同一管當成是template嗎?
02/22 12:08, 10F
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02/22 16:07, , 11F
加在一起後我們會先煮沸sample再讓它緩慢恢復室溫 再做PCR
02/22 16:07, 11F
推
02/22 17:15, , 12F
RACE kit
02/22 17:15, 12F
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文章代碼(AID): #1H9UGQhE (Biotech)
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