[求救] WB後壓出來的band很weak

看板Biotech作者 (唉唷喂~)時間13年前 (2013/01/10 16:36), 編輯推噓4(4推 0噓 12→)
留言16則, 10人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
最近在做WB, protein濃度已經下到200ug了, 結果band還是很weak, 就算是壓tubulin, 也不是很明顯 步驟大概是跑完gel將protein transfer到PVDF membrane後, 用1:5000下一抗(兩種抗體同時壓, 其中一個是tubulin), 室溫作用30-60min, 冰4度o/n, 隔天在下二抗, 室溫作用60min, 再壓片(1小時和2小時) 請問各位大大 是哪裡出了問題? 還是因為抗體壞掉了?? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 120.114.181.198
推
01/10 16:56, , 1F
2nd Ab titer?
01/10 16:56, 1F
推
01/10 18:18, , 2F
先檢查tansfer效率, 個別一抗先試合理titer, 再抓二抗titer
01/10 18:18, 2F
→
01/10 18:19, , 3F
舊片, 先用新配二抗再試看看, 不行, 往回檢查.
01/10 18:19, 3F
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01/10 20:30, , 4F
用200ug的超多量,又壓片只有1,2h兩時間點,我猜band早燒掉了
01/10 20:30, 4F
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01/11 00:43, , 5F
先跟別人借ECL來用用
01/11 00:43, 5F
推
01/11 10:21, , 6F
也有可能是顯影劑跟定影劑失效
01/11 10:21, 6F
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01/13 19:25, , 7F
燒掉了吧....壓tubulin從沒超過1分鐘
01/13 19:25, 7F
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01/13 21:40, , 8F
200ug tubulin不可能壓不爆qq 也可跟別人借抗體試試
01/13 21:40, 8F
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01/13 21:42, , 9F
也可檢查或重配transfer buffer或TBST 看是否壞掉才壓不到
01/13 21:42, 9F
推
01/13 23:59, , 10F
你tubulin應該是燒掉了吧!!
01/13 23:59, 10F
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01/15 13:22, , 11F
washing condition 呢？會不會洗太久或搖太大力了點兒？
01/15 13:22, 11F
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01/23 23:25, , 12F
有沒有想過是不是一開始protein定量就有問題
01/23 23:25, 12F
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01/23 23:27, , 13F
換句話說就是你認為你下到200，其實因為定量時沒有扣掉
01/23 23:27, 13F
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01/23 23:28, , 14F
background，讓你高估了protein量
01/23 23:28, 14F
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01/23 23:29, , 15F
會提出這個問題是因為有些測定protein量的KIT
01/23 23:29, 15F
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01/23 23:29, , 16F
在某些物質存在下，會影響讀值
01/23 23:29, 16F
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文章代碼(AID): #1GxdrvcV (Biotech)
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