Re: [求救] 跑western幾個步驟上的問題
※ 引述《emilyliu (微笑下的真實)》之銘言：
: 各位板友好 幾個有關western的問題想請教
: 1. overnight的話 停在blocking或上一抗overnight (一樣都放在冰箱搖)
: 或者200mA transfer 這三種都有看過，請問比較建議停在哪一個步驟？
: 三者對於band會有影響嗎？
Blocking是我自己覺得比較好的停點, 背景髒的話可以block overnight
不然我是放在冰箱靜置而已
上一抗的話怕會太髒 在Transfer的話要看membrane是否會跳海使用
我是不覺得會對band本身有什麼太大影響啦
: 2. 上抗體後(不論一抗二抗)放在冰箱或室溫下搖對實驗會有影響嗎？
: 看過有的實驗室不管一抗二抗一定都放冰箱，有的卻是都放在室溫而已？
這其實跟經驗與在地調整有關 在哪個實驗室最好就跟著那邊的步驟做做看
做不出來再談調整比較好 畢竟每個實驗室用的reagent多少有些差異
看課本操作是很理想化的方式 但不實際 功課做過後多問比較實際
室溫好處就是抗體結合快速 我們家二抗才半小時XD
另一個溫度的影響就是抗體本身 如果抗體脆弱又想要重複使用
4度並且長時間的一抗反應大概就免不了了
通常會放到4度 overnight都有可能是抗體不行了 或者是東西看不到才會
這麼做
: 3. 我跑的檢體主要是動物組織，常常會有background 很髒，band不夠sharp
: 的問題有嘗試增加wash的次數，不過效果似乎有限，之前有聽朋友說過可以
: 延長二抗的時間，(我二抗時間一個小時，他說他是四個小時放冰箱) ，我
: 還沒有試過，想了很久不是很懂為什麼？至於跑出來的band常常會糊糊的不
: 夠sharp，有加過trypsin，但是band常常會跑掉，和原本在該出現的位置會
: 有一點落差，裁membrane常常會裁到有點困擾，效果似乎也還好，
: 想請教板友有什麼方法可以改善嗎？
背景是個很難解的問題 調整抗體濃度與結合溫度是我覺得最有希望的
其他如加強wash時間或加強blocking時間 甚至換掉blocking agent
都是有可能的解
Band很糊就有可能要回頭去檢討是不是電泳的問題
若是懷疑抗體可以用確定的sample進行一次positive的測試
是買的話至少跑出來不要跟抗體附的datasheet上面差得太遠才行
實驗室置備的抗體也不要跟學長姐跑的差太遠才OK
: 我知道每間實驗室對於跑western都有自己的protocol，我想請教的是，
: 像transfer的時間 (400mA 2~4hr 或200mA overnight) ，上抗時間的
: 長短(Ex: overnight 和兩個小時）對於跑出來band好不好的影響在哪裡？
: 問題有點多，希望有板友能指教 謝謝
重點不在哪樣做比較好 畢竟各實驗室實際情況不同前面有提過
跑的sample也不同 因此很難比較
通常會說反應慢跑出來的東西就漂亮
非專一性結合少 Blocking又完整 Wash也很完整
所以要在低溫操作 連transfer最好也慢慢來
但在某些sample的操作中 這樣的龜毛反而浪費很多時間
而有時候這樣的步驟不夠龜毛又偵測不到蛋白質
因此就需要試....調整western有時真的需要不少功夫
--
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 111.249.179.74
推
07/18 08:50, , 1F
07/18 08:50, 1F
討論串 (同標題文章)
本文引述了以下文章的的內容：
完整討論串 (本文為第 2 之 2 篇)：