[求救] 跑western幾個步驟上的問題

看板Biotech作者emilyliu (微笑下的真實)時間12年前 (2012/07/17 21:46)推噓1(1推 0噓 7→)

留言8則, 3人參與討論串1/2 (看更多)

各位板友好幾個有關western的問題想請教 1. overnight的話停在blocking或上一抗overnight (一樣都放在冰箱搖) 或者200mA transfer 這三種都有看過，請問比較建議停在哪一個步驟？三者對於band會有影響嗎？ 2. 上抗體後(不論一抗二抗)放在冰箱或室溫下搖對實驗會有影響嗎？看過有的實驗室不管一抗二抗一定都放冰箱，有的卻是都放在室溫而已？ 3. 我跑的檢體主要是動物組織，常常會有background 很髒，band不夠sharp 的問題有嘗試增加wash的次數，不過效果似乎有限，之前有聽朋友說過可以延長二抗的時間，(我二抗時間一個小時，他說他是四個小時放冰箱) ，我還沒有試過，想了很久不是很懂為什麼？至於跑出來的band常常會糊糊的不夠sharp，有加過trypsin，但是band常常會跑掉，和原本在該出現的位置會有一點落差，裁membrane常常會裁到有點困擾，效果似乎也還好，想請教板友有什麼方法可以改善嗎？我知道每間實驗室對於跑western都有自己的protocol，我想請教的是，像transfer的時間 (400mA 2~4hr 或200mA overnight) ，上抗時間的長短(Ex: overnight 和兩個小時）對於跑出來band好不好的影響在哪裡？問題有點多，希望有板友能指教謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.46.149.183

→

RickyKckao

07/18 01:43, , 1^F

07/18 01:43, 1^F

→

RickyKckao

07/18 01:43, , 2^F

07/18 01:43, 2^F

→

RickyKckao

07/18 01:44, , 3^F

07/18 01:44, 3^F