[求救] transfer 糊掉

看板Biotech作者 (咩)時間13年前 (2012/06/21 17:38), 編輯推噓4(4推 0噓 12→)
留言16則, 7人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
traget protien: 10~15KDa (in 12% sds gel) transfer condition: 0.22 um PVDF, 400mA 1hr 因為一直都壓不到我的protein, 下圖是將PVDF染Ponceau S後的結果 http://ppt.cc/~mDh http://ppt.cc/StAV 上片段較大size整個飄移,不知是不是濾紙加的不夠多 or 實驗室有人說是下層膠沒做好或是上層膠的柵欄歪了(我有確定柵欄OK) 下方比較嚴重的是明顯15KDa後什麼都不見了~ 麻煩請大家幫我想想問題大概在哪裡,已經test好多次了都是一樣的結果 感謝QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 211.76.175.170 ※ 編輯: spirithorse 來自: 211.76.175.170 (06/21 17:38)
推
06/21 18:47, , 1F
transfer電流太強了，低分子量的蛋白穿透PVDF跳海了
06/21 18:47, 1F
→
06/21 21:14, , 2F
謝謝,請問有比較推薦的transfer條件嗎?
06/21 21:14, 2F
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06/21 22:34, , 3F
感覺上transfer之前就出問題了,gel跑完上面的一切都ok嗎？
06/21 22:34, 3F
※ 編輯: spirithorse 來自: 114.35.0.61 (06/21 23:07)
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06/21 23:08, , 4F
sorry我transfer後沒染膠,但是過程中看front dye正常
06/21 23:08, 4F
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06/21 23:51, , 5F
應該是過熱,導致糊掉..是濕式還是半乾式??
06/21 23:51, 5F
推
06/21 23:53, , 6F
但我覺得marker也有點怪, 跑膠也有問題的樣子
06/21 23:53, 6F
推
06/21 23:54, , 7F
若是半乾式400mA,1小時已經跳海,膜下的濾紙應該有MARK
06/21 23:54, 7F
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06/21 23:56, , 8F
的痕跡...給完整的流程,才能一一解答...
06/21 23:56, 8F
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06/22 00:31, , 9F
這個可以入選殿堂了@_@" 換濕式的轉看看? buffer??
06/22 00:31, 9F
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06/22 00:39, , 10F
召喚: http://ppt.cc/qe_Q 建議染一片膠看看跑得如何吧
06/22 00:39, 10F
推
06/22 08:59, , 11F
SDS-PAGE running buffer check 一下正確否?
06/22 08:59, 11F
抱歉我沒講清楚,transfer是用溼式 400mA 1hr ※ 編輯: spirithorse 來自: 211.76.175.170 (06/22 11:23)
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06/22 23:09, , 12F
濕式裡頭放冰雹,外頭用冰加水,300mA 1hr 試看看
06/22 23:09, 12F
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06/22 23:11, , 13F
或條件不變,PVDF膜疊二張,二張都染看看,4OOmA沒放冰
06/22 23:11, 13F
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06/22 23:14, , 14F
很容易過熱,雖然我是菜鳥研究助理,但western有6年經驗
06/22 23:14, 14F
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06/23 00:08, , 15F
樓上的經驗在原po前文的推文都出現過，應該很難重蹈吧
06/23 00:08, 15F
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06/23 00:14, , 16F
原po先前文的圖每個lane平整,對照下gel的問題才該先解決
06/23 00:14, 16F
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