Re: [求救] 請教realtime PCR 定量

看板Biotech作者 (琴心)時間13年前 (2012/06/04 06:43), 編輯推噓7(7推 0噓 13→)
留言20則, 6人參與, 最新討論串2/3 (看更多)
: 最近在整理 PCR資料的時候想到的問題 : : 如果實驗本身做了三重複 得到三個cDNA sample (a, b, c) : 接著PCR對每個sample做三重複，2^-dct method 得到9個資料點 : (a1, a2, a3, b1, b2, b3, c1, c2, c3) : : 請問各位板友，下面三種資料呈現方式哪一個比較正確呢？ : : 1. 選擇三次實驗中具代表性的一次，如(a1+a2+a3)/3±SD, n=3 : 2. (a1+a2+a3+..+c1+c2+c3)/9±SE, n=9 : 3. 取三次實驗各自的平均值，a', 'b, c'，接著以(a'+b'+c')/3±SE, n=3 : : 推 williamyang:若是實驗結果趨勢是一至的,選1 05/30 14:20 : 推 icehikki:我都用二 05/30 15:18 : → blence:如果是上述cDNA定量,用1.是測你的機器的mechanistic error 05/30 15:56 : → blence:做100次也沒有意義,應該用3.才能比較代表三次exp的error 05/30 16:01 : → blence:至於其它實驗端看你計算平均值時想要呈現的SD代表什麼意義 05/30 16:03 : → ckr:謝謝三位板友的意見 05/30 19:20 : 推 qqmango:2是錯的，應該是用3，1的話會有主觀選擇的偏差問題 05/31 01:24 : → ckr:謝謝q板友的說明 05/31 09:53 : 推 bigtuna:3不知會不會把"人為誤差"給忽略了，用2似較能算進人為誤差 06/03 01:55 : → bigtuna:不過不是很確定，也想要和大家一起討論:) 06/03 01:58 昨天與學統計的朋友交換意見 他是不贊同2這個方法的 2的問題在於把九個資料點視為九次獨立事件 但我們都知道同次實驗三個測量值(如a1, a2, a3)三者關係比較接近 而不同次實驗的測量值之間(如a1, b1)關係比較遠 所以這個方法邏輯上有漏洞 因此在三個選項當中 3似乎是最合乎統計學理的 但或許九個資料點也可以用repeated measures的角度切入?(Friedman's test?) 這得要請教對生物統計更專精的板友了 順帶一提 學統計的朋友對於我們多半選擇t-test或ANOVA很訝異 因為在n值很小的時候 應該是要用non-parametric的方法才符合學理 (Mann-Whitney or Kruskal-Wallis) 而且描述non-parametric data的時候 不應該是用Mean, SD, or SE 應該改用Median, IQR等 老實說 討論之後覺得更頭大 從我淺薄的統計修課所得的認識 用non-parametric的方法確實比較合理 但在閱讀期刊的過程當中 似乎沒見到用non-parametric方法在處理realtime PCR資料 ※ 編輯: ckr 來自: 184.57.23.82 (06/04 06:47)
推
06/04 06:56, , 1F
大多數人就將錯就錯.... 習慣就好了
06/04 06:56, 1F
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06/04 07:09, , 2F
可以請教lingon大都選用上面哪種方式分析嗎?
06/04 07:09, 2F
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06/04 13:43, , 3F
2不能說完全不對，當每一次種細胞就分三盤取得的data,連續
06/04 13:43, 3F
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06/04 13:45, , 4F
重複這樣的實驗共三次，就能用2,當然這時也可以用3甚至1,
06/04 13:45, 4F
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06/04 13:48, , 5F
總之重複實驗是為了暸解並排除誤差,不同方法的解釋就會不同
06/04 13:48, 5F
如果我們假設今天的細胞跟下禮拜沒有差別 我同意b大的實驗設計可以用方法2 但我原文提出來的狀況是一個RNA sample做三次PCR 在這種狀況下 同個sample的三次結果不是獨立的 而會因為實驗設計而高度相關 如此一來好像不太適合給予等同三個sample的地位?
推
06/04 20:02, , 6F
2絕對是錯的，不然只要做兩次實驗，然後測十重覆的話n=20?
06/04 20:02, 6F
同意q大說法 對1個RNA sample跑10次PCR 可信度應該不如 10個RNA sample各跑1次PCR 我猜b大所謂2的算法可行是指 今天實驗有三盤細胞 明天實驗又做三盤細胞 這樣跟今天一次做六盤細胞的結果都可以視為n=6 (雖然兩次三重複的可信度 似乎略高於一次六重複) 個人的看法是 不論是一次做六重複 或做兩次三重複 都屬於真正的replicate 都有6個RNA sample n就等於6 至於跑realtime PCR時的重複 嚴格來說應該算是repeated measurements 不能算在n值裡頭 ※ 編輯: ckr 來自: 164.107.154.93 (06/05 05:37)
推
06/05 15:21, , 7F
請見jcb的好文error bars in experimental biology
06/05 15:21, 7F
推
06/05 15:23, , 8F
那樣仍只是看你的操作再現性而已
06/05 15:23, 8F
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06/05 17:38, , 9F
不同意樓上,因為一次做六隻老鼠,跟分兩次做三隻老鼠量血壓
06/05 17:38, 9F
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06/05 17:40, , 10F
沒有理由前面是n=1,後面n=2,像這樣應該都是n=6
06/05 17:40, 10F
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06/05 17:42, , 11F
你認為不妥的例子應該是一隻測量六次跟兩隻各測三次
06/05 17:42, 11F
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06/05 17:44, , 12F
之前已經說過了,一個QPCR值連續讀十次,對做實驗還是n=1,但
06/05 17:44, 12F
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06/05 17:48, , 13F
對機器與偵測精準度n=10,究底就是每個人立場看待n值有差異
06/05 17:48, 13F
推
06/05 18:20, , 14F
請見該文章,我想這樣爭論沒什麼意義，對得起自己的數據就
06/05 18:20, 14F
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06/05 18:20, , 15F
好
06/05 18:20, 15F
推
06/05 23:29, , 16F
N值偏少我的統計老師教我用Linear mixed effect model
06/05 23:29, 16F
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06/05 23:30, , 17F
去作統計.
06/05 23:30, 17F
推
06/12 17:02, , 18F
用原文的說法的確2是錯的 但如果是每次做三重複 一共做三
06/12 17:02, 18F
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06/12 17:03, , 19F
次 應該就可以當作n=9 當然在真正統計學範疇上 這跟作法3
06/12 17:03, 19F
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06/12 17:03, , 20F
還是有差別
06/12 17:03, 20F
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文章代碼(AID): #1Fo-YgXC (Biotech)
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