[求救] 用kit抽plasmids

看板Biotech作者 (Wengda)時間14年前 (2012/02/24 18:27), 編輯推噓7(7推 0噓 2→)
留言9則, 6人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
各位大大您好 小弟最近將一個基因接到一個plasmid載體上後 ! 轉型到DH5-alpha內, 塗盤挑single colony ! 再O/N培養, 之後取 2.5 ml 的菌液用kit抽plasmids ~ 用廠商的elution buffer回溶 100 ul ! 也用這 elution buffer 當Blank ! 測出來的濃度約是50-100 ng/ul , 之後再分四管 , 每管約150ng plasmids (1) 用EcoRI+HindIII切兩刀 (2) 用EcoRI切一刀 (3) 用HindIII切一刀 (4) 都沒切 再去跑1%的Agarose gel ! 問題來了 第1-3的位置都比 4的位置(下面)小一點 因為切開了 所以長度比較正確 ! (這應該沒問題) 問題在於1 , 一沒有出現 我想要的band ! 老師說可能是我算錯濃度 ! 濃度太高 所以切不動 = = ! 所以想問問 抽出來的plasmids 這樣的濃度合理嗎 ? 他叫我 要放到 3-4 ug ! 可是我抽出來的量 沒那麼多啊 >< -- 我愛妳 用生命的愛 ~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 203.64.80.74
推
02/24 18:37, , 1F
會不會很衰的是兩個質體互相接起來了~因為沒看到做AP或CIP
02/24 18:37, 1F
推
02/24 20:11, , 2F
plasmid size正確嗎？你定序過確定裡頭有insert？
02/24 20:11, 2F
推
02/24 20:25, , 3F
問題同二樓，你有作colony PCR看有沒有接近去嗎？
02/24 20:25, 3F
→
02/24 20:26, , 4F
你們老師應該沒做過實驗吧...這兩個RE隨便切都切一大堆
02/24 20:26, 4F
推
02/24 23:55, , 5F
理論上高度 2=3>4>1才對吧 1=2=3?
02/24 23:55, 5F
推
02/24 23:59, , 6F
用ta系統照廠商條件做很難失敗 該不會你只挑1顆?
02/24 23:59, 6F
推
02/25 01:29, , 7F
2跟3的位置一樣嗎
02/25 01:29, 7F
推
02/25 18:19, , 8F
怎麼可能... 你是用口水切嗎 單位ug都照切好嗎...
02/25 18:19, 8F
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02/25 18:21, , 9F
plasmid拿去PCR一下 夾出你的片段 準確又省DNA
02/25 18:21, 9F
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