Re: [求救] 真菌transform的方法
試著回答一下 不過不確定有沒有回答到你的問題
基本上酵素作用完要取protoplast的時候，
最簡單的方法就是直接低速離心把protoplast離心到管子底部，
取掉上清液後，再用高張溶液把protoplast重新懸浮起來
我猜測你參考的protocol應該是為了更加保護protoplast，
所以把1.2M sucrose當作緩衝襯在protoplast跟管子底部之間，
以免protoplast在離心時擠壓在管子底部受到傷害而影響存活率。
至於分層的問題，除非你的酵素處理液顏色很深，否則本來就很難有分層，
如果protocol正確的話，你應該是取在兩種液體理論上的交界處
(在管子裡加完1.2M sucrose後就可以在液面處做個記號，
兩種液體低速離心時應該不容易混合，大部分protoplast也不會跑到1.2M sucrose裡面)
(要測試有沒有取對地方的話，你可以每個地方都取一些拿去鏡檢)
PS: 基本上做protoplast的小技巧超多的，你應該請教身邊有做過的人比較安全
其他轉型方法還有農桿菌、基因槍、電穿孔等
(by 花了三年在做真菌轉型的人......)
※ 引述《peggie0903 (dwz.tw/57pn)》之銘言：
: 大家好 我最近在做Aspergillus的transformation
: 大致上是將孢子隔夜培養後
: 再用vino taste酵素處理兩小時 去除細胞壁 得到protoplast
: 之後再用1.2M sucrose為底 上層放培養液去離心
: 理論上protoplast應該會出現在培養液跟蔗糖的介面
: 但是我就是無法看到那明顯的分層.......
: 已經困擾很久了 拿不到protoplast的話就無法進行transform
: 可不可以請有經驗的版友 提供我真菌transform的方法？
: 或是提供一些意見
: 感謝大家了
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 124.8.85.160
推
02/24 13:27, , 1F
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