Re: [求救] MTT assay 處理組數值高於控制組
※ 引述《FireHell (冥煌 = 好硬)》之銘言：
: 標題: Re: [求救] MTT assay 處理組數值高於控制組
: 時間: Thu Dec 29 21:11:44 2011
:
: ※ 引述《unwell ( )》之銘言：
: : 已經爬過文了沒看過有人問
: : 請教板友
: : 我做的試驗是在caco-2貼附後 加入某藥品進行攻毒
: : 另外添加兩個菌數的某菌
: : 想看該菌可否使藥品對caco-2的傷害降低
: : 結果
: : control是沒加藥品也沒加菌 OD值平均視為100%
: : 只加藥品組OD值是控制組的80% (嗯 還OK)
: : 重點來了
: : 只加低菌數某菌組OD值居然是control的200%!!
: : 我想說 會不會是caco-2跟菌之間有吸附的關係 所以測MTT時也同時測到菌了
: : 但在只加高菌數某菌組OD值是control的120%
: : 而在藥品與菌共同treat下則都低於100%
: : 嗚哇我該如何解釋
: : MTT assay結果 實驗組比control還高呢?
: : 甚至達到200%???
: : 補充
: : 1. 96-well 細胞數: 2x10^4/well 100 μl/well
: : 2. 因為有菌的處理 反應時間設定只有12h
: : 3. 在加入MTT之前 有用200 μl PBS wash 2次
: : 4. triplicate, standard error挺小的
: : 謝謝各位了~~~
: : ※ 編輯: unwell 來自: 140.112.154.104 (12/29 17:17)
: : 推 FireHell:加入MTT之前不可以用PBS wash，會把酵素洗掉 12/29 17:47
: : → FireHell:很多人會犯這個錯誤 12/29 17:47
: : → unwell:MTT是加在medium裡處理細胞反應4h 不是測那4h產的酵素? 12/29 18:25
:
: 3-4 h是MTT跟succinate dehydrogenase完全反應所需的時間，
: 不是為了讓細胞產生酵素的時間。
: 當然這段時間細胞也會產酵素，但量少。
:
: : → unwell:如果會洗掉酵素 那吸掉medium那步時不就也吸掉酵素了??? 12/29 18:29
: : → unwell:謝謝大家的回應 12/29 18:29
: : 推 icome:要測的dehydrogenase在mitochondria 不會被洗掉 12/29 18:40
:
: 不多說看paper吧(可惜是殘體的)：
: http://wenku.baidu.com/view/b290102fed630b1c59eeb578.html?from=related
:
: 緩慢吸掉的medium與medium對照組無顯著差異，所以不會吸掉很多酵素。
: 但是PBS洗一次吸光值降低80%；洗兩次降低98%。
: 再不相信就自己實驗看看有洗跟沒洗的差異吧，
: 我自己就試過了，吸光值會差非常的多！
: 如果吸光值太低，即使都是跟control比，data仍會有很大的系統誤差。
:
: --
: ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
: ◆ From: 140.112.218.89
: 推 aceliang:我實在看不太懂這篇文章...就表11而言，將樣品混勻是要？ 12/29 22:09
: → aceliang:既然細胞表面的SDH被洗起，那為什麼上清液組沒有formazan 12/29 22:10
: → aceliang:又如果細胞表面沾滿了SDH，那MTT本身的意義勢必得打折了 12/29 22:11
: → aceliang:大概是我慧根不足吧XDDD 12/29 22:12
: → FireHell:跟樓上有過一樣的疑問，這篇很多地方說的不清楚 12/29 22:38
: → FireHell:所以我就自己去試了，有洗兩次比都沒洗的吸光值下降了0.4 12/29 22:40
: → FireHell:原因的部份我也是對作者的推論存疑 12/29 22:46
: → a001ou:你提供的文獻反而表示要洗兩次 如此可有效降低培養基中 12/29 22:53
: → a001ou:SDH的量 12/29 22:55
: → FireHell:樓上您看的跟我看的是同一篇嗎？ orz 12/29 23:01
: → a001ou:樓上要不要先瞭解MTT原理再來? MTT是測細胞"內"粒線體呼吸 12/29 23:30
: → a001ou:鍊活性 今天你說wash會導致MTT結果減弱 那表示包外充滿會 12/29 23:31
: → a001ou:造成MTT形成紫色結晶的物質(不論是酵素還是化學物質) 那就 12/29 23:32
: → a001ou:表示若不wash 那MTT結晶幾乎都是包外物質造成的 如此將嚴重 12/29 23:33
: → a001ou:影響MTT所要觀察的粒線體活性 why？因為wash不會洗到胞"內" 12/29 23:35
: → a001ou:的粒線體 12/29 23:35
: 樓上講話很嗆喔，MTT原理我還要你教？
: 你有看到paper的結論5嗎？所以三位作者都不懂MTT原理呢！introduction寫假的？
: 你要不要先了解MTT的目的再來？主要是測prolifiration耶！
: 哪篇教科書限定胞內粒線體上的SDH才能是指標，其它的SDH也是細胞分泌的就不算？
: 可以麻煩您找給我嗎？
: 況且你又如何確定wash時胞內的SDH不會釋出？你就這麼肯定？文獻呢？
: 你可以多去打聽其它實驗室或其它學校怎麼做，加MTT前不wash的一堆好嗎？
小弟不才 在此發表一些個人淺見
F大提供的這篇paper中 第109-110頁提到下列兩點:
1.琥珀酸脫氫脢(succinate dehydrogenase, SDH)是細胞生長代謝產物
2.琥珀酸脫氫脢會分泌到細胞外 並附著在細胞膜上
作者對於這段論述並沒有提供參考文獻
為此 我自己查了一下生化課本
發現SDH是存在粒線體內膜 在電子傳遞鏈的作用中 扮演著重要的角色
似乎並不能算是一種代謝產物(?)
另外 為何在粒線體內膜的酵素會分泌到細胞外?
印象中在細胞凋亡時 粒線體膜的結構破裂 才會讓其中的蛋白質被釋放至細胞質中
假如正如作者所言 SDH會附著在細胞膜上 那其功能又為何? 生理功能又會是甚麼?
而SDH在細胞內又是甚麼反應的代謝產物呢?
另外 回到原po的問題
在您的實驗設計中 MTT assay可能不是一個適合的方法
因為多數細菌也會表現SDH
而用MTT assay控恐怕無法分辨 所測量到的SDH活性 究竟是來自caco-2或是細菌
或許您可以改用死菌來做實驗 就不會有上述的問題
亦或是利用其他的研究方法 如板友推文提到的 PI染色
小弟不才 在論述中有錯誤的地方 還請各位先進指教
: 推 icome:可能是細胞凋亡釋放出來的 找不到SDH會被釋放的文獻 12/30 00:19
: → blence:MTT不只用來測proliferation,NADH-NAD pool測量也能用 12/30 00:44
: → soom:請板友討論時避免情緒性言詞 12/30 09:44
: 推 unwell:謝謝原PO的回應 但是我wash了兩次 是為了把菌盡量wash乾淨 12/30 11:41
: 推 unwell:而且即使wash了兩次最後OD值都很高 甚至扣掉blank後還 >1 12/30 11:47
: → unwell:>1會不呈線性 我會再調整 不過我還是想問 有沒有可能這個菌 12/30 11:48
: → unwell:會刺激粒線體裡酵素的表現 如果是 那其他做藥物處理測MTT的 12/30 11:50
: → unwell:試驗不就都可能得考慮會不會刺激酵素的表現而結果誤差很大 12/30 11:51
: → FireHell:回樓上原原PO，OD值高是因為您種的濃，如果真的有wash必 12/30 13:15
: → FireHell:要，您又考量SDH遭受菌或藥物影響，可以考慮改用PI stain 12/30 13:16
: → FireHell:作為您測存活率的方法 12/30 13:16
: → FireHell:MTT assay作為viability確實有其前提，像飢餓(serum free 12/30 13:28
: → FireHell:的環境下就可能會因autophagy降低SDH的量，值得注意 12/30 13:29
: → FireHell:又比如說在complete medium環境下以autophagy inhibitor 12/30 15:46
: → FireHell:(3-MA, CQ) treat細胞，會得到>100%的結果 12/30 15:47
: ※ 編輯: FireHell 來自: 140.112.98.115 (12/30 15:47)
: → a001ou:那你要不要解釋一下你的推文 什麼叫做很多人犯的錯誤 加 12/31 00:11
: → a001ou:MTT前不該wash？ 完全是誤導別人 還怪別人嗆? 12/31 00:11
: → a001ou:有多少protocol跟原理說明wash不影響MTT 你卻任意引用一篇 12/31 00:12
: → a001ou:說得不清不楚的文獻卻用肯定的語氣來支持這充滿問題的結果 12/31 00:13
: → a001ou:你真的覺得這樣誤導別人是正確的? 12/31 00:14
: → a001ou:還是說你有很好得證據支持你說wash"可以"有效抑制粒線體活 12/31 00:16
: → a001ou:性 導致MTT結果失準? 毫無證據的亂說 我這態度剛好而已 12/31 00:17
: 推 martyrtitan:樓上 原PO不就有嘗試過了? 12/31 00:59
: → martyrtitan:版主都說避免情緒用詞了 這麼嗆有必要嘛 12/31 01:00
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 118.168.87.197
※ 編輯: APPswe 來自: 118.168.87.197 (12/31 16:35)
※ 編輯: APPswe 來自: 118.168.87.197 (12/31 16:35)
推
01/01 19:24, , 1F
01/01 19:24, 1F
推
01/02 12:09, , 2F
01/02 12:09, 2F
討論串 (同標題文章)
以下文章回應了本文：
完整討論串 (本文為第 3 之 4 篇)：