Re: [求救] MTT assay 處理組數值高於控制組

看板Biotech作者 (冥煌 = 好硬)時間14年前 (2011/12/29 21:11), 編輯推噓5(5推 0噓 35→)
留言40則, 8人參與, 最新討論串2/4 (看更多)
※ 引述《unwell ( )》之銘言： : 已經爬過文了沒看過有人問 : 請教板友 : 我做的試驗是在caco-2貼附後 加入某藥品進行攻毒 : 另外添加兩個菌數的某菌 : 想看該菌可否使藥品對caco-2的傷害降低 : 結果 : control是沒加藥品也沒加菌 OD值平均視為100% : 只加藥品組OD值是控制組的80% (嗯 還OK) : 重點來了 : 只加低菌數某菌組OD值居然是control的200%!! : 我想說 會不會是caco-2跟菌之間有吸附的關係 所以測MTT時也同時測到菌了 : 但在只加高菌數某菌組OD值是control的120% : 而在藥品與菌共同treat下則都低於100% : 嗚哇我該如何解釋 : MTT assay結果 實驗組比control還高呢? : 甚至達到200%??? : 補充 : 1. 96-well 細胞數: 2x10^4/well 100 μl/well : 2. 因為有菌的處理 反應時間設定只有12h : 3. 在加入MTT之前 有用200 μl PBS wash 2次 : 4. triplicate, standard error挺小的 : 謝謝各位了~~~ : ※ 編輯: unwell 來自: 140.112.154.104 (12/29 17:17) : 推 FireHell:加入MTT之前不可以用PBS wash，會把酵素洗掉 12/29 17:47 : → FireHell:很多人會犯這個錯誤 12/29 17:47 : → unwell:MTT是加在medium裡處理細胞反應4h 不是測那4h產的酵素? 12/29 18:25 3-4 h是MTT跟succinate dehydrogenase完全反應所需的時間， 不是為了讓細胞產生酵素的時間。 當然這段時間細胞也會產酵素，但量少。 : → unwell:如果會洗掉酵素 那吸掉medium那步時不就也吸掉酵素了??? 12/29 18:29 : → unwell:謝謝大家的回應 12/29 18:29 : 推 icome:要測的dehydrogenase在mitochondria 不會被洗掉 12/29 18:40 不多說看paper吧(可惜是殘體的)： http://wenku.baidu.com/view/b290102fed630b1c59eeb578.html?from=related 緩慢吸掉的medium與medium對照組無顯著差異，所以不會吸掉很多酵素。 但是PBS洗一次吸光值降低80%；洗兩次降低98%。 再不相信就自己實驗看看有洗跟沒洗的差異吧， 我自己就試過了，吸光值會差非常的多！ 如果吸光值太低，即使都是跟control比，data仍會有很大的系統誤差。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.218.89
推
12/29 22:09, , 1F
我實在看不太懂這篇文章...就表11而言，將樣品混勻是要？
12/29 22:09, 1F
→
12/29 22:10, , 2F
既然細胞表面的SDH被洗起，那為什麼上清液組沒有formazan
12/29 22:10, 2F
→
12/29 22:11, , 3F
又如果細胞表面沾滿了SDH，那MTT本身的意義勢必得打折了
12/29 22:11, 3F
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12/29 22:12, , 4F
大概是我慧根不足吧XDDD
12/29 22:12, 4F
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12/29 22:38, , 5F
跟樓上有過一樣的疑問，這篇很多地方說的不清楚　　　　
12/29 22:38, 5F
→
12/29 22:40, , 6F
所以我就自己去試了，有洗兩次比都沒洗的吸光值下降了0.4
12/29 22:40, 6F
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12/29 22:46, , 7F
原因的部份我也是對作者的推論存疑
12/29 22:46, 7F
→
12/29 22:53, , 8F
你提供的文獻反而表示要洗兩次 如此可有效降低培養基中
12/29 22:53, 8F
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12/29 22:55, , 9F
SDH的量
12/29 22:55, 9F
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12/29 23:01, , 10F
樓上您看的跟我看的是同一篇嗎？ orz
12/29 23:01, 10F
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12/29 23:30, , 11F
樓上要不要先瞭解MTT原理再來? MTT是測細胞"內"粒線體呼吸
12/29 23:30, 11F
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12/29 23:31, , 12F
鍊活性 今天你說wash會導致MTT結果減弱 那表示包外充滿會
12/29 23:31, 12F
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12/29 23:32, , 13F
造成MTT形成紫色結晶的物質(不論是酵素還是化學物質) 那就
12/29 23:32, 13F
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12/29 23:33, , 14F
表示若不wash 那MTT結晶幾乎都是包外物質造成的 如此將嚴重
12/29 23:33, 14F
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12/29 23:35, , 15F
影響MTT所要觀察的粒線體活性 why？因為wash不會洗到胞"內"
12/29 23:35, 15F
→
12/29 23:35, , 16F
的粒線體
12/29 23:35, 16F
樓上講話很嗆喔，MTT原理我還要你教？ 你有看到paper的結論5嗎？所以三位作者都不懂MTT原理呢！introduction寫假的？ 你要不要先了解MTT的目的再來？主要是測prolifiration耶！ 哪篇教科書限定胞內粒線體上的SDH才能是指標，其它也是細胞分泌的就不算？ 可以麻煩您找給我嗎？ 你可以多去打聽其它實驗室或其它學校怎麼做，加MTT前不wash的一堆好嗎？
推
12/30 00:19, , 17F
可能是細胞凋亡釋放出來的 找不到SDH會被釋放的文獻
12/30 00:19, 17F
→
12/30 00:44, , 18F
MTT不只用來測proliferation,NADH-NAD pool測量也能用
12/30 00:44, 18F
→
12/30 09:44, , 19F
請板友討論時避免情緒性言詞
12/30 09:44, 19F
推
12/30 11:41, , 20F
謝謝原PO的回應 但是我wash了兩次 是為了把菌盡量wash乾淨
12/30 11:41, 20F
推
12/30 11:47, , 21F
而且即使wash了兩次最後OD值都很高 甚至扣掉blank後還 >1
12/30 11:47, 21F
→
12/30 11:48, , 22F
>1會不呈線性 我會再調整 不過我還是想問 有沒有可能這個菌
12/30 11:48, 22F
→
12/30 11:50, , 23F
會刺激粒線體裡酵素的表現 如果是 那其他做藥物處理測MTT的
12/30 11:50, 23F
→
12/30 11:51, , 24F
試驗不就都可能得考慮會不會刺激酵素的表現而結果誤差很大
12/30 11:51, 24F
→
12/30 13:15, , 25F
回樓上原原PO，OD值高是因為您種的濃，如果真的有wash必
12/30 13:15, 25F
→
12/30 13:16, , 26F
要，您又考量SDH遭受菌或藥物影響，可以考慮改用PI stain
12/30 13:16, 26F
→
12/30 13:16, , 27F
作為您測存活率的方法
12/30 13:16, 27F
→
12/30 13:28, , 28F
MTT assay作為viability確實有其前提，像飢餓(serum free
12/30 13:28, 28F
→
12/30 13:29, , 29F
的環境下就可能會因autophagy降低SDH的量，值得注意
12/30 13:29, 29F
→
12/30 15:46, , 30F
又比如說在complete medium環境下以autophagy inhibitor
12/30 15:46, 30F
→
12/30 15:47, , 31F
(3-MA, CQ) treat細胞，會得到>100%的結果
12/30 15:47, 31F
→
12/31 00:11, , 32F
那你要不要解釋一下你的推文 什麼叫做很多人犯的錯誤 加
12/31 00:11, 32F
→
12/31 00:11, , 33F
MTT前不該wash？ 完全是誤導別人 還怪別人嗆?
12/31 00:11, 33F
→
12/31 00:12, , 34F
有多少protocol跟原理說明wash不影響MTT 你卻任意引用一篇
12/31 00:12, 34F
→
12/31 00:13, , 35F
說得不清不楚的文獻卻用肯定的語氣來支持這充滿問題的結果
12/31 00:13, 35F
→
12/31 00:14, , 36F
你真的覺得這樣誤導別人是正確的?
12/31 00:14, 36F
→
12/31 00:16, , 37F
還是說你有很好得證據支持你說wash"可以"有效抑制粒線體活
12/31 00:16, 37F
→
12/31 00:17, , 38F
性 導致MTT結果失準? 毫無證據的亂說 我這態度剛好而已
12/31 00:17, 38F
結果你還是沒有提供任何的文獻、親手做任何的實驗 而以上這兩件事我都做了，我也不知道該說什麼了 =.=
推
12/31 00:59, , 39F
樓上 原PO不就有嘗試過了?
12/31 00:59, 39F
→
12/31 01:00, , 40F
版主都說避免情緒用詞了 這麼嗆有必要嘛
12/31 01:00, 40F
※ 編輯: FireHell 來自: 140.112.218.89 (01/01 23:54)
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