[求救] Western transfer

看板Biotech作者 (Martyrs)時間12年前 (2011/12/19 00:56), 編輯推噓7(7推 0噓 10→)
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又是一個transfer的困擾了 我要看的是Microtubule associated protrein (MAP1B, MAP2) 這兩個蛋白質的MW大致為270 kDa左右 20% methnol 0% SDS 的transfer buffer (有預冷) 濕式 (hoefer 8*9cm^2) 450mA 2.5hr 和 3hr 膠體都有殘留 但我確定沒過頭(我墊兩張PVDF) 這次改用爬文的buffer條件 10% methnol 0.05% SDS (有預冷) 450mA 2.5hr transfer的時候泡泡超多 transfer完我染膠和膜 兩個都沒有....(第二層PVDF也沒有) 我確定電極沒插反 (PVDF上有很糊的marker...) 請問各位前輩 是有什麼問題造成的呢？ 補充：Total protein 37.5ug marker 5uL 另外請問一下..能Transfer到一半置換buffer嘛? 想說如果可以..buffer變溫後就換另一瓶冰的buffer (有包冰 也有預冷) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.98.129 ※ 編輯: martyrtitan 來自: 140.112.98.129 (12/19 00:57)
推
12/19 09:22, , 1F
marker會很糊的話你transfer在設置的時候應該就有問題
12/19 09:22, 1F
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12/19 09:22, , 2F
和protein大小無關
12/19 09:22, 2F
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12/19 09:23, , 3F
270kDa的話要不要試試semidry?
12/19 09:23, 3F
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12/19 10:07, , 4F
我們家只有濕式的
12/19 10:07, 4F
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12/19 10:08, , 5F
之前用20% Methnol和SDS-free的buffer, marker很清楚
12/19 10:08, 5F
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12/19 10:09, , 6F
這次我跑兩張 一張marker不見了 一張很糊
12/19 10:09, 6F
※ 編輯: martyrtitan 來自: 140.112.4.195 (12/19 10:10)
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12/19 10:15, , 7F
糊糊的話也有可能是過熱 放4度.......
12/19 10:15, 7F
這倒是有可能....
推
12/19 17:50, , 8F
也有可能是沒夾緊
12/19 17:50, 8F
有夾緊
推
12/19 23:34, , 9F
大kDa蛋白用wet比較好吧= ="~怎麼不試試100mA o/n?!
12/19 23:34, 9F
忘記所上有一間Cool room....
推
12/20 11:32, , 10F
PVDF是有先浸潤過100％methanol or 95%ethanol for 5min?
12/20 11:32, 10F
有低 ※ 編輯: martyrtitan 來自: 140.112.98.129 (12/20 12:57)
推
12/20 13:41, , 11F
該不會是PVDF有問題？
12/20 13:41, 11F
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12/20 13:46, , 12F
我用400mA 1hr，就可以把170kDa轉過去。
12/20 13:46, 12F
推
12/20 14:25, , 13F
連marker都湖就是條件有問題了,大Kda是會比較難轉過去
12/20 14:25, 13F
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12/20 14:25, , 14F
但是不可能會影響到你的marker,重新確認一次所有的條件
12/20 14:25, 14F
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12/20 14:26, , 15F
然後放冷房或冰箱跑,可以的話就用o/n的條件跑會更好
12/20 14:26, 15F
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12/20 14:26, , 16F
至於電流開多大就看你tank多大,然後去查一下就知道了
12/20 14:26, 16F
推
01/12 15:52, , 17F
可能過熱的成分比較多
01/12 15:52, 17F
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文章代碼(AID): #1ExXjQgd (Biotech)
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