Re: [求救] PCR 跑膠internal control一直不equal
※ 引述《starjim (Jim)》之銘言：
: PCR完跑膠
: 但是卡在internal control一直不equal
: 導致一直無法繼續往下做
: 我用的internal control是beta-actin
: 已經重新跑過幾次PCR了
: 甚至連RT都重做了
: 可是就是一直卡在某個lane比較weak
: 每次跑完就是那個lane比weak
: 甚至我還把PCR完的product拿去用nanodrop測DNA濃度
: 結果是每管的濃度都差不多
分享我的經驗，如果和大家的見解不同，希望大家和我一起多討論!
關於測濃度這件事
在PCR完後，轉cDNA後
測的濃度包含了樣本中的dNTP/rNTP、用剩的primer和solvent中其他的物質
這些在OD260都會吸收的!
所以沒辦法反應出真正的PCR product量
要測的話 要先做完clean-up(酒精沉澱或用kit)再測才是準的
: 我已經想不到有什麼方法可以解決這問題了
: 請問板上的高手有什麼其他的方法嗎?
: 謝謝~~
關於internal control equal這個要求，
我覺得樣本處理的很重要，
我的經驗是，每一管的組織/樣本量一定要固定，
固體組織類的要確實秤量，
例如葉子等的要確實吸乾表面上的水再秤，
細菌的定量，一定要確實用pippet弄散測完OD，再取菌液做實驗
還有如果是微量核酸樣本的話(像血清中的病毒)，
要加入carrier RNA/DNA (>3ug)後再純化，才能確保純化過程中每一管的效率相等，
另外如果要做RT，RNA純化的最後一步要用DNase處理，
ELUTION完成後再以OD260的值來normalize，確保拿去做RT的RNA量相同，
(有些方法或kit不保證能移除PRIMER，這時不適用)
然後在配PREIX時，我建議在分裝PREMIX時，每一管都要用新的TIP，
因為有些TIPA體沾黏，這樣通常會造成最後幾管的值怪怪的，
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.140.43.81
※ 編輯: pocession 來自: 114.140.43.81 (06/18 23:51)
※ 編輯: pocession 來自: 114.140.43.81 (06/18 23:54)
※ 編輯: pocession 來自: 114.140.43.81 (06/18 23:55)
※ 編輯: pocession 來自: 114.140.43.81 (06/18 23:57)
討論串 (同標題文章)
本文引述了以下文章的的內容：
完整討論串 (本文為第 2 之 2 篇)：