[求救] PCR 跑膠internal control一直不equal

看板Biotech作者 (Jim)時間14年前 (2011/06/16 20:46), 編輯推噓1(1推 0噓 23→)
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PCR完跑膠 但是卡在internal control一直不equal 導致一直無法繼續往下做 我用的internal control是beta-actin 已經重新跑過幾次PCR了 甚至連RT都重做了 可是就是一直卡在某個lane比較weak 每次跑完就是那個lane比weak 甚至我還把PCR完的product拿去用nanodrop測DNA濃度 結果是每管的濃度都差不多 我已經想不到有什麼方法可以解決這問題了 請問板上的高手有什麼其他的方法嗎? 謝謝~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 203.71.94.31
推
06/16 21:00, , 1F
PCR跑完去測濃度 沒有意義 因為buffer有鹽類 會干擾
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你換GAPDH試試吧
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06/16 21:03, , 3F
因為我只是想確定product濃度是不是一樣
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06/16 21:04, , 4F
那測cDNA的濃度會有意義嗎?因為我也有測= =
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每一管都有鹽類 背景值應該相同吧？
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不然 blank 可以用一管沒跑 PCR 的 mix 去做
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06/16 21:26, , 7F
恩... 照樣可以normalize吧 可能你那特定sample的
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RNA quality比較差一點
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只要cycle數抓住 還是可以normalize吧
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不然就是那組的treatment造成細胞數差異
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根據你的敘述跟我的經驗 我也只能這樣troubleshooting
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cDNA或PCR產物若未純話去測濃度差不多，只能表示你的dNTP
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加的很準，你可以直接拿一點dNTP去測就知道了
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可能beta-actin不是這實驗適合的internal control,建議可多找
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找幾種常用的internal control gene做做看
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那就把其他lane 都弄到一樣weak
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不然就換GAPDH吧
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目前又做一次已經算equal了~另外我也跑了GAPDH
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只是還沒跑膠而已~謝謝各位的幫忙~~
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06/20 16:38, , 20F
差很多嗎? 沒有差很多的話可以用image J做normalize
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如果差到肉眼可見兩倍以上就有點多了
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我是用image J定量耶
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可是肉眼看起來差不多~但是訂了就差大約0.9倍左右
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訂了之後跑完肉眼看起來差不多
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文章代碼(AID): #1D-Viohj (Biotech)
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