[求救] 要怎麼cloning最快

看板Biotech作者時間14年前 (2011/06/16 22:06), 編輯推噓4(4推 0噓 15→)
留言19則, 9人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
想請問各位，作cloning時拿去定序後 發現選出來insert gene有些地方序列有錯 請問你們會整個再從pcr開始，重新ligation 還是把上次ligation剩下的再重新transform呢？ 我都挑不到全對的序列，已經用pfu dna polymerase了！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.234.242
推
06/16 22:15, , 1F
如果有人告訴你的話 請你也告訴我 Orz
06/16 22:15, 1F
推
06/16 22:26, , 2F
搞不好template就錯了阿= =
06/16 22:26, 2F
推
06/16 22:38, , 3F
其實在等答案的這兩天，就又再重新做完一次了
06/16 22:38, 3F
→
06/16 22:47, , 4F
PCR cycle數多少啊?? 小於25 cycles做看看
06/16 22:47, 4F
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06/16 22:48, , 5F
35cycle.......是減少chycle數減少erro rate嗎
06/16 22:48, 5F
推
06/16 23:17, , 6F
mutagenesis回正確的sequence
06/16 23:17, 6F
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06/17 06:41, , 7F
我覺得直接用之前的去transform 挑菌後 多挑幾顆去定序
06/17 06:41, 7F
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06/17 06:45, , 8F
但真要說快的話 就是每種方法同時嘗試直到做出來為止 XD
06/17 06:45, 8F
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06/17 14:06, , 9F
如果重弄template還是錯一樣地方，有可能是物種差異而跟da
06/17 14:06, 9F
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06/21 21:50, , 10F
基本上PCR要出錯得機率不高~
06/21 21:50, 10F
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06/21 21:51, , 11F
跑完PCR有用gel extraction純化你的insert嗎??
06/21 21:51, 11F
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06/21 21:52, , 12F
再來所謂挑不到全對的序列~指的是那種錯誤??
06/21 21:52, 12F
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06/21 21:53, , 13F
是point mutation還是有deletion??還是序列全錯??
06/21 21:53, 13F
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06/21 21:54, , 14F
如果是point mutantion就請多挑幾顆去訂序
06/21 21:54, 14F
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06/21 21:55, , 15F
如果是delection或是insertion奇怪的序列~~
06/21 21:55, 15F
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06/21 21:55, , 16F
請檢查你的primer是否黏到錯的地方
06/21 21:55, 16F
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06/21 21:56, , 17F
如果訂序結果全部都不對...那應該contaminate了!!
06/21 21:56, 17F
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06/21 22:06, , 18F
對了~訂序結果不是還會附一張訊號圖!!
06/21 22:06, 18F
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06/21 22:07, , 19F
看看訊號有沒有很雜亂~~那也是判斷之一!!
06/21 22:07, 19F
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文章代碼(AID): #1D-Wtxyd (Biotech)
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