[求救] Ligation一直接不出來...

看板Biotech作者 (睡魔海 )時間14年前 (2011/05/06 12:29), 編輯推噓13(13推 0噓 16→)
留言29則, 15人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
我的insert大小是1050bp vector大小是9193bp insert已經接到TA vector上 定序也確定序列都對 現在是設計帶有EcoRI跟XbaI restriction site的primer forward:gctctagagc-atg....... reverse:cggaattccg-tta....... 然後經過PCR放大insert之後 做一次DNA elution 再來將insert跟vector作RE,37度C,40min (之所以會切這麼短時間,因為老闆說放太久EcoRI會亂切...) 然後65度C inactivation,15min 之後拿去run gel 作gel elution 測完濃度之後準備作ligation insert跟vector濃度大都在50ng/ul 我的vector input 75ng 我已經試過molar ratio vector:insert=1:3,1:5,1:10 然後T4 DNA ligase 1ul,2 X buffer 5ul 總體積10ul, ligation overnight 隔天做transformation competent cell是用益生的DH10B 也用過JM109 之前有做過轉空vector進去有成功 transform的過程: competent cell半融就將10ul的ligation product加進去 放在冰上30min 接著做heat shock,42度C,90s 冰上3分鐘 接著加700ul的LB buffer(無 Ampicillim),37度C,1hr 7000rpm離心2min 抽掉上清液留下pellet,再加75ulLB buffer(無 Ampicillin) resuspension 最後塗盤(100ug/ml Ampicillin) 16hr之後收盤 都沒有長... 請問我的實驗的問題出在哪裡>"< 請高手出手相救 感激不盡 ※ 編輯: flyhuman 來自: 140.116.253.121 (05/06 12:31)
推
05/06 12:42, , 1F
先positive control確定transform沒問題，然後再確認
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05/06 12:43, , 2F
ligation沒問題(PC)，然後其實切兩個小時EcoRI不會怎樣
05/06 12:43, 2F
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ligation體積可以放大到20uL，感覺不是步驟的問題
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05/06 12:45, , 4F
看看材料方面有沒有狀況吧。ligase buffer壞了之類的(猜)
05/06 12:45, 4F
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05/06 13:11, , 5F
ligation 溫度？
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推
05/06 13:12, , 6F
如果一直接不起來 我建議你把PCR產物再接一次到TA上 這樣
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05/06 13:13, , 7F
至少能確定digest沒問題 我實在不怎麼信任PCR產物直接切
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05/06 13:15, , 8F
heat shock 90s會不會太久?! 我看到建議的都低於60s耶...
05/06 13:15, 8F
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05/06 14:56, , 9F
heat shock建議不要超過45S... ligation試試看4度O/N
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推
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我家lab就是90s效果比45s好~
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推
05/06 15:20, , 11F
#1Dk6LayG 參考一下
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抱歉>"< ligation是4度C overnight
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推
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我以為ligation都是12~16度C o/n的說
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推
05/06 17:20, , 14F
vector兩切位如果緊鄰或太近，要分開切不要一起切；要確定
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primer設計的切位兩側至少要多幾個bp，RE才比較切得成功。
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我cloning通常失敗是敗在RE cleavage這一步，後續反而還好
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推
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insert切40min也太短了吧 至少兩小時 若有加BSA不至於亂切
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我之前還切過一個晚上的 結果沒事
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推
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請問轉形效率好嗎？還有也可以用PCR來確認ligation步驟喔
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不過ligation產物不好PCR就是了
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還有PCR產物你這樣切40分鐘～很危險..有很大的機率沒切乾淨
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如果是我我會切2小時～當然酵素量要夠
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05/06 23:06, , 23F
EcoRI切個1.5hr以上吧 不會亂切啦, 大概load 2ug下去切
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推
05/06 23:15, , 24F
偷切一管長時間的看看 先不要讓老闆知道
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推
05/07 14:28, , 25F
EcoRI應該還好啦~ 我放過夜也沒事@@
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05/07 14:29, , 26F
Ligase會有問題嗎 要不要換一下
05/07 14:29, 26F
推
05/09 20:20, , 27F
看看Ligase有沒有問題~我之前一直做不出來就是ligase壞掉
05/09 20:20, 27F
推
05/12 14:49, , 28F
有個問題 你拿多少DNA去做gel extract? 測濃度50ng/ul有
05/12 14:49, 28F
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05/12 14:50, , 29F
順便寄他的260/230嗎?怕是沒DNA 只是鹽類的peak太高而已
05/12 14:50, 29F
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文章代碼(AID): #1DmtakmN (Biotech)
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