Re: [求救] 限制酶切不好......

看板Biotech作者yaliu (雅)時間15年前 (2010/08/27 00:19)推噓4(4推 0噓 13→)

留言17則, 5人參與討論串2/2 (看更多)

※ 引述《nurXiah ()》之銘言： : 最近要把insert換到另一個載體(8kbp) : insert的部分用相同的限制酶已經切好了跑膠check size也是對的 : 但用同樣的限制酶去切載體(transform到細菌內大量複製,再抽完plasmid)卻一直切不好 : 兩種限制酶試過作用37度 3h,4h,5h 但要切膠回收時跑出來的band都怪怪的 : 有位置明顯不對的有跑出好幾條band的(照理說應該是兩條) 也有band上方有拖拖的痕跡會是質體濃度太濃？？？沒切乾淨？？沒切成功的質體conformation不同，就會有不同band出現 : 切完膠用kit回收再跑膠check 出來的都是兩條band(照理來講回收完應該只有一條) 切哪條band呢？確定那條真的是切成功的嗎？ : 限制酶各取1ul 也有用指定的buffer plasmid取30ul/100ul和50ul/60ul ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 什麼意思？？如果你質體用kit抽小量質體切30ul這麼大量 1ul酵素可能不太有力喔.....說明書上標榜的活性我覺得參考用啦（不過也要取決於你的濃度啦，因為我質體通常都抽蠻濃的）因為vector最好確保能夠完全切乾淨酵素不用太省啦～用多一點（但也有上限喔～忘記不得超過幾%了） : 可是目前做了6,7次還是做不出來XD : 為了怕有離子干擾 elute都是用滅菌過的二次水 : 但爬文後發現很多人有做純化的動作實驗室是沒有這樣做不知道純化的必要性大不大 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 你不是已經切膠純化了？？？ : 麻煩經驗豐富的版友給個建議前面做不出來後面ligation也不用做了XD -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 122.117.195.131

推

ararthur

08/27 01:35, , 1^F

08/27 01:35, 1^F

→

ararthur

08/27 01:37, , 2^F

08/27 01:37, 2^F

推

Ianthegood

08/27 07:44, , 3^F

08/27 07:44, 3^F