Re: [求救] 請問his tag的純化方法
※ 引述《championelmo (elmo軒)》之銘言：
: 實驗室第一次要做enzyme assay
: 我們手上拿的載體是pET-32系列 又有在改過
: 之前再做western blot時使用的抗體是有專一性很高的 S-protein kit
: 有抓到 有顯示出band
: 之後因為要做純化 為了省錢就選用his tag
: 以plasmid map來看 我們的目標蛋白是接在s protein後面 但是前面不遠處(約差200bp)
: 就是his tag的序列了 應該也是抓得到目標蛋白
: 但是現在通column的結果 量很少 跑膠有band 但有其他的雜band(不是單一band)
: 想說提高imidazole的濃度 卻又沒有band了
: 想請問有經驗的朋友 如果遇到這種情形還有哪些方法我可以去嚐試
: 不希望非得要換S˙tag (太貴了...)
可能的原因很多
如果是採用 his tag純化的話
或許可以試試在Western Blotting時使用anti-his tag antibody測試his tag
是否有被擋住
如果his tag沒有問題的話
那可能是單純的表現量不夠
解決辦法就像版友回的以量取勝
多養一些菌液以增加回收量
關於雜質的問題
請問你提高imidazole濃度是提高到多少
我記得resine的說明書中提到不要超過60 mg/L
建議是以高量低濃度反覆多沖洗幾次觀察是否有改善
希望對你有幫助
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◆ From: 125.227.225.142
推
07/12 13:31, , 1F
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