Re: [求救] 請問vector與insert序列中皆有ATG？

看板Biotech作者Fourfish (～四條魚～)時間14年前 (2010/05/01 15:01)推噓4(4推 0噓 8→)

留言12則, 3人參與討論串3/3 (看更多)

※ 引述《wangba (原來...)》之銘言： : 標題: Re: [求救] 請問vector與insert序列中皆有ATG？ : 時間: Sat May 1 04:49:31 2010 : : ※ 引述《yp (熊皮)》之銘言： : : 請問各位先進 : : 目前有一vector cloning site之前有設計一組ATG, : : 而手邊要使用的insert 其起始序列也含有ATG, : : 接入之後經過計算此兩個ATG是不同的frame. : : 1. 請問這時的蛋白質表現是會為何？ (僅有vector的僅有insert的還是皆有?) : : Insert的部份能夠表現出預期的蛋白質嗎？我的經驗跟想法是 "不會產生insert的蛋白" 因為跟translation有關係 Translation的發生有一定的規則通常以最接近ribosome binding site (RBS)的ATG開始translation 以prokaryote而言這個RBS的位置也通常在promoter上距離第一個ATG 也就是vector上的ATG約10bp 如果你用的是pET系列的vector 注意一下map就會發現這個特徵所以不管你的insert有沒有ATG cell都會以vector的ATG做translation 當insert跟vector ATG是不同的frame時是產不出protein的因此建議你重新設計primer把insert弄成in frame的吧（這也是做clone所應該注意的第一步）而如果是W大的作法有難度存在因為就像我上面說的 RBS跟第一個ATG只距離約10bp 要在不砍掉RBS的情形下拿掉vector ATG 必須要剛好有RE site在RBS跟ATG中間就算不認為RBS是重要的 vector ATG前面也一定是promoter region 也要顧慮到會不會砍到operator、activator和promoter等region 所以這樣做完plasmid有沒有能力產protein也是個大問題.... 結論就是... 砍掉重clone比較快... PS.我是沒做過把vector ATG拿掉如果真的要做是有辦法但作法就比較複雜而且是否能產protein真的是個問題 : : : 如果是我我的作法是拿掉Vector上的ATG : : 畢竟利用Vector上的ATG會多出幾個amino acid : : 並不是原來的序列恕刪 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.94.205

推

bluecsky

05/01 17:16, , 1^F

05/01 17:16, 1^F

→

bluecsky

05/01 17:16, , 2^F

05/01 17:16, 2^F

→

bluecsky

05/01 17:17, , 3^F

05/01 17:17, 3^F