Re: [求救] 請問vector與insert序列中皆有ATG？
※ 引述《yp (熊皮)》之銘言：
: 請問各位先進
: 目前有一vector cloning site之前有設計一組ATG,
: 而手邊要使用的insert 其起始序列也含有ATG,
: 接入之後 經過計算 此兩個ATG是不同的frame.
: 1. 請問這時的蛋白質表現是會為何？ (僅有vector的 僅有insert的 還是皆有?)
: Insert的部份能夠表現出預期的蛋白質嗎？
: 2. 若是不行的話 請問各位有何建議？
: 如：需重設計引子 然後使用vector的ATG?
: 換掉vector? (由於實驗限制 這點暫不考慮)
: .........
如果是我 我的作法是拿掉Vector上的ATG
畢竟利用Vector上的ATG會多出幾個amino acid
並不是原來的序列
至於說要如何拿掉呢
我用圖示來說明好了
EcoRI V BamHI I
GAATTC ---ATG---GGATCC--ATG---
===>digest with EcoRI and BamHI
===>run gel to remove Vector's ATG
===>klenow fill in and ligase
===> GAATTGATCC--ATG
當然 這裡的 EcoRI 和 BamHI只是舉例
如果沒有適合的cutting site
同樣的方法也可以改在inser上 使其in frame
比如說
V BamHI I
ATG CA GGATCC ATG
===>digest with BamHI
===>klenow fill in and linase
===>ATG CA G GAT C GA TCC ATG
同樣地 這裡的BamHI也只是舉例
要注意的是klenow只能補齊5'突出的cutting site
像是3'突出的KpnI就不能用這方法
只能用nuclease digest的方法
同時如圖示 一次多幾個base是由突出幾個base決定的
除了klenow之外 也可以用polymerase補齊
至於如何使用klenow就要參照使用說明 不在這篇的討論範圍
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推
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