Re: [求救] 請問lentivius的問題~~十萬火急~~畢業困難
※ 引述《longko (觀音兵)》之銘言：
: 板上各位好
: 最近~~我開始使用lentivirus 系統~~我從中研院訂購了幾組shRNA~~再lentivirus前
: 先將幾組shRNA利用transfection的方式將plasmid送到HEK-293T細胞，做knockdown
: 照理來說，會在western blot測試中，看到目標蛋白被抑制，可是幾次結果下來，
: 並未看出差異。
: 我是使用invitrogen的Lipofectamine 2000將plasmid送入細胞，48小時候收蛋白，
^^^^^^^^^^^^^^
: 過程中並無篩許，只有對照pEGFP-plasmid做為control。
: 而這幾組shRNA中研院的測試結果都是有效的，所以在我pre-test的結果來看，該己
: 組shRNA就沒有效果，請問各位前輩我有沒有忽略什麼細節或少考慮了什麼。
你transfect哪些plasmid到293T細胞裡做PACKAGE?
pCMV delta8.91 + pMD.G + 你從中研院買的表現shRNA的plasmid
是這樣吧?
所以你transfect 48小時之後 應該是收病毒吧? 不是收蛋白吧!
and 經驗談 通常transfect 36小時的病毒titer是最高的, 24h或48h的病毒量都較少
然後你PACKAGE好病毒之後 感染的步驟也很重要
感染時所加的病毒濃度, 時間 都會影響
目前我試的GENE, 在病毒感染三天後,mRNA會下降,
但是protein要至少四五天才會顯著knockdown
給你參考一下囉!
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03/28 14:43, , 1F
03/28 14:43, 1F
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