Re: [求救] western的internal control 調不勻
※ 引述《katty7389 (吹跑了~)》之銘言：: 大家好我是做western blotting的新手
: 9.將取得的sample做定量
: １０。定量的結果假設為２.４１μg/μl,我每個well想loading 40μg.就加
: １６。５μl的sample與４μl ６x的sample buffer混勻(無論多少sample
:
: 都加４μl的sample buffer)
: 11.100度煮protein 10分鐘
: １２。loading sample
: 有錯麻煩大家指正 謝謝
10.以你的方式每sample 應該要補水到20μl再加4μl sample buffer 才符合所謂的6倍
Sample Buffer有一個作用主要是讓蛋白溶在Glycerol
loading Sample時才能有效沉澱到Well內
你原本的配法會造成蛋白濃度高的沉澱較多濃度少的就沉澱較少
多的蛋白就會往上漂
補水與不補水我都用過
所有Sample補水到同體積會使跑出來的Band都一樣長比較好看
不補水的比較適合loading較大量蛋白
每個Sample buffer加的數量是 定量後/5 (你原本的就是16.5/5=3.3)
因沉澱快band會較細較亮
但當每個Sample量差很多時Band就會有長有短
比較不好看
還有就是配Sample時Sample buffer要先搖的非常均勻再加
每片loading時速度要快 減少Sample擴散的時間
趕快Runnig讓Sample趕快跑進上層膠
減少一些人為的誤差
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